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IPTG(367-93-1)诱导蛋白表达的原理及方法步骤

 E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表达 。在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经b-半乳糖苷酶催化,转变为半乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。  

 
1、诱导表达材料 
( 1 ) LB (Luria—Bertani))培养基 
酵母膏 (Yeast extract) 5g 蛋白胨 (Peptone) 10g NaCl 10g 琼脂 (Agar) 1-2% 
蒸馏水 (Distilled water) 1000ml pH 7.0 适用范围:大肠杆菌 
( 2 ) IPTG 贮备液:2 g IPTG溶于10 mL 蒸馏水中,0 . 22 μm 滤膜过滤除菌,分装成1 mL /份,-20 ℃ 保存。 
( 3 ) l× 凝胶电泳加样缓冲液: 50 mmol / L Tris -CI ( pH 6 . 8 ) 50 mmol / L DTT 2 % SDS (电泳级) 0.1 % 溴酚蓝 10 % 甘油 
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白纯化材料 
 
1 )酶溶法 (1)裂解缓冲液: 
50 mmol / L Tris-CI ( pH 8 . 0 ) 1 mmol / L EDTA 100 mmol / LNaCI 
(2)50 mmol / L 苯甲基磺酰氟(PMSF )。 (3)10 mg / mL 溶菌酶。 (4)脱氧胆酸。 
(5)1 mg / mL DNase I。 2 )超声破碎法 ( 1 ) TE 缓冲液。 
( 2 ) 2×SDS -PAGE 凝胶电泳加样缓冲液: 100 mmol / L Tris-HCI ( pH 8 . 0 ) 100 mmol / L DTT 4 %SDS 0.2 % 溴酚蓝 20 % 甘油 实验方案 
1、外源基因的诱导表达 
( 1 )用适当的限制性内切核酸酶消化载体DNA 和目的基因。 ( 2 )按连接步骤连接目的基因和载体,并转化到相应的宿主菌。 
( 3 )筛选出含重组子的转化菌落,提取质粒DNA 作限制性内切核酸酶图谱,DNA 序列测定, 确定无误后进行下一步。 
 
( 4 )如果表达载体的原核启动子为PL 启动子,则在30 -32 ℃ 培养数小时,使培养液的OD600达0.4-0.6 ,迅速使温度升至42 ℃ 继续培养3 -5h ;如果表达载体的原核启动子为tac 等,则37 ℃培养细菌数小时达到对数生长期后加IPTG 至终浓度为1 mmol / L。继续培养3 -5h 。 
( 5 )取上述培养液1 mL , 1000g 离心,1 min ,沉淀,加100 μL 聚丙烯酰胺凝胶电泳上样缓冲液后,作SDS -PAGE 检测。 
2、大肠杆菌包涵体的分离与蛋白质纯化 1 )细菌的裂解 
常用方法有:① 高温珠磨法;② 高压匀浆;③ 超声破碎法;④ 酶溶法;⑤ 化学渗透等。前三种方法属机械破碎法,并且方法① 、② 已在工业生产中得到应用,后三种方法在实验室研究中应用较为广泛。下面介绍酶溶法和超声破碎法的实验步骤。 
(1)酶溶法。常用的溶解酶有溶菌酶;β-1,3 -葡聚糖酶;β-1,6 -葡聚糖酶;蛋白酶;壳多糖酶;糖昔酶等。溶菌酶主要对细菌类有作用,而其他几种酶对酵母作用显著。主要步骤为: 
① 4 ℃ ,5000rpm 离心,15 min ,收集诱导表达的细菌培养液(100 mL )。弃上清,约每克湿菌加3 mL 裂解缓冲液,悬浮沉淀。
 本文由苏州亚科科技编辑部编辑整理