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四甲基联苯胺 TMB (54827-17-7)双组份显色液配制方法探讨

   辣根过氧化物酶(HRP)是酶联免疫吸附测定(ELISA)中应用较多的一种标记酶,尤其是在国内。在HRP检测系统中,常用的生色底物有邻苯二胺(OPD)2, 2’-吖嗪-(3-乙酰苯基噻唑-6-磺酸)(ABTS )3, 3' , 5, 5’-四甲基联苯胺(TMB)。前两种底物因为有潜在的致癌作用,现已逐渐被更为安全和敏感的TMB所替代。现市而上已有多家公司生产的商品化TMB显色剂出售,国内规模化的生产TMB粉剂的企业主要有苏州亚科化学试剂股份有限公司等,国外的有SIGMA. KPL. RapidBioLabThinity Biotech等。在相关实验中特别是需要使用大量显色剂的实验,如单克隆抗体制备过程中阳性克隆的筛选,其实验成本将大幅度上升。所以,研制成本低廉、效果理想的TMB液体显色剂是十分必要的。从以上目的出发,我们参考国内外相关文献,以TMB粉剂为主要原材料,经过反复实验、修改优化溶液的组成成分及含量,最后成功制得了敏感、稳定而又低廉的双组分TMB显色剂。此显色剂分为A.B组分,使用时,将A液用B液稀释50倍即可。各组分在4℃能稳定保存1年以上;ELISA检测敏感胜与进口产品无显著差异,而本底控制则要优于进口产品。

1材料与方法

1.1材料TMB粉剂(苏州亚科科技股份有限公司);DMSO、丙三醇、叶温20、亚硫酸钠、柠檬酸、磷酸氢二钠.EDTA(广东光华化学厂有限公司);过氧化氢酶(苏州亚科科技股份有限公司);进口显色剂:TMB 1-Component Microwell Peroxidase Substrate (KPL ); L-半肤氨酸盐酸盐(广州市普博仪器有限公司);小鼠IgG、兔抗小6 IgG. HRP标记兔抗小6 IgG. HRP标记羊抗小鼠IgG鼎国生物技术有限公司);12孔高结合力ELISA板条(BIOEIL);洗板机4Mk2 CThermo);酶标仪(BIORAD2550 )

1.2方法

    双组分TMB显色剂的配制A液将TMB粉剂溶解于DMSO中使最终浓度为11mg/ml,然后加入1/10体积的甘油,再加入终浓度为0.5mg/mlL一半肤氨酸盐酸盐(所有操作要避光进行)。配好后的A液置于深色玻璃瓶中并保存4℃。 B液用去离子水配制,使各成分的终浓度如下:0.15%柠檬酸、0.25%磷酸氢二钠、0.01%亚硫酸钠、0.002%EDTA0.001%吐温200.02%过氧化氢脲。将配好的溶液121℃高压灭菌30 min, 0.22μm滤膜过滤,置于深色塑料瓶中于4℃保存。使用时,将A液用B液稀释50倍,混匀后即可。

1.2.2 与进口TMB显色剂的效果对比本文采用三种ELISA将我们配制的显色剂与进口试剂进行了对比。反应条件如无特殊说明均为:抗原于4℃包被过夜并弃去液体;5%脱脂奶粉37℃封闭2h,洗板5次并甩干液体;按具体实验方法分别依次加入一抗(或抗原)、标记二抗,一抗反应1h,二抗反应30 min,每一步反应结束后弃液、洗板5次并甩干液体。两种显色剂分别与37℃显色5 min, 2M H2SO4终比,酶标仪测OD450。每个实验做三复孔并重复三次,结果取平均值。

1.2.3 稳定性实验A.B液配好后保存于4℃,然后每隔一个月取出配成工作液,测OD450直接用酶标抗体测定其敏感性随时间的变化,具体过程如下:HRP标记羊抗兔IgGPBST稀释20000倍,然后加入到ELISA板条中,3μl孔,共12孔,再加入100μl孔显色剂于37℃反应5 min, 2M H2SO4终止,酶标仪测OD450,结果取平均值。

1.2.4 统计学分析在本文中我们应用了Repeated measuresone-way ANOVA . Two-way ANOVAPaired t test

结果

2.1 本显色剂与进口试剂显色效果的对比我们采用不同的ELISA体系对本显色剂和进口试剂的显色效果进行了对比。在直接法中,我们包被不同浓度的小鼠IgG,然后加入工作浓度的HRP标记羊抗小鼠IgG;在间接法中,包被固定浓度1μg/ml的小鼠IgG,然后加入倍比稀释的兔抗小鼠IgG;夹心法按试剂盒说明书操作,加入倍比稀释的阳性对照。结果显示,我们配制的TMB显色剂在显色敏感性方而与进口试剂相比无显著性差异(1A,图1B,图1C,P>0.05);而在空白对照的本底控制方而,配制的TMB则要优于进口试剂(1D,P0.05)。为了进一步检测本显色剂的显色效果,我们用直接ELISA检测了显色不同时间后的OD450。变化。结果显示,本显色剂显色较快,在显色1 min后即能达到0.5左右;然后随着时间的延长,显色越来越深,在显色后11 min左右OD450达到峰值3.1,而后较长时间内维持在峰值,见图2

2.2 稳定性实验结果TMB溶液不稳定,在保存过程中易于自发氧化而影响显色效果,使检测的结果不稳定,本底升高。对此,在显色剂的保存过程中,每隔一段时间我们测其工作液的OD630,结果显示在1年保存期内本显色剂十分稳定,基本无自发氧化显色,见图3;直接用H RP标记的二抗进行显色,检测其敏感性变化,见图4.

3讨论

    在本文中,我们描述了一种新型的双组分TMB显色剂的配制。此显色剂与进口试剂相比,在敏感性、稳定性方而无显著差异,而在本底的控制上则要优于进口试剂且成本低廉。为实验室相关检测特别是需要使用大量显色剂的检测提供了一个理想的选择。

    TMB显色剂的配制中,TMB的溶解度是一个最关键的因素,因为它直接影响到检测的敏感性。在实验过程中我们发现,TMB在纯水中的溶解度<0.2 mg/ml,所以必须加入一定量的有机溶剂以增加其溶解度。在我们所实验过的有机溶剂当中(DMSO、甘油、乙醇、甲醇、异丁醇、DMADMF), TMBDMSO中的溶解度是最大的(20mg/ml,故在A液中我们用DMSO作为溶剂。但高浓度的有机溶剂(5%)会降低显色效果,所以A液中TMB的浓度为10mg/ml,稀释后工作液中有机溶剂的浓度为2%, DMSO的熔点为18.5℃,在4℃保存过程中为固体,使用不方便,所以我们在其中加入了10%的甘油,使其在4℃时为液态。另外我们发现甘油能降低TMB的自发显色,增加其稳定性。

    研究显示,HRPpH5.5-6.0之间有最佳的催化活性,所以在本显色剂的B液中,其pH值为5.5。我们也试验了在其他pH值下的显色效果,结果显示:pH4. 5 - 6. 5之间,TMB的显色效果无显著差异。H2O2的浓度对显色效果也有影响,太低则显色不充分,太高则会抑制显色,其最佳的浓度范围是1-2.5 mM。在ELISA实验中,最常出现的一个问题就是显色终止后出现沉淀,特别是显色较深的情况下,从而使得检测结果不准确。其机制不明,国内外也无相关文献报道。在本实验的前期,我们也确实碰到过此类问题,最后发现其与溶液的离子强度有关:离子强度越大,显色终止后则越容易出现沉淀,反之亦然。所以要解决显色后出现沉淀的问题,可从以下两方而考虑,一是降低终止液的浓度,二是降低显色剂的离子强度(本显色剂所采用)。但离子强度不能太低,否则溶液的缓冲能力就会急剧下降而影响显色效果。

摘自:《实用预防医学》08年第6期

 

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