结构搜索Structure Search

    全站搜索Search

    在线客服Online Support

  •  医药部客服  电子化学客服

    当前位置: 专题聚焦

GTC|593-84-0|法与试剂盒法在提取分枝杆菌RNA中的对比

2017-3-29
        结核病是全世界十大死因之一,据WHO报道,2015年,1040万人患有结核病,180万人因该病死亡。结核病由结核分枝杆菌引起,在分子水平上研究其致病与耐药机制迫在眉睫,对其RNA的提取是分子生物学研究的重要常规实验。有研究人员将异硫氰酸胍(GTC)裂解液和RNA提取试剂盒提取分枝杆菌RNA进行了对比[1],本文将对其进行总结。
异硫氰酸胍法
        在无菌离心管内加入500μL去污液溶液(120mM醋酸钠,9.6%Tween-80,pH4),500μL水饱和酚,100μL氯仿/异戊醇(24:1)及几颗直径2~3mm的无菌玻璃珠,放置于冰上预冷。
        取一定量的卡介苗(BCG)培养物放在无菌离心管中,加入1.5mL GTC溶液,10.5μL β-巯基乙醇,涡流混匀,5,000g,4℃离心30min,再以13,000g,4℃离心60s,使菌体沉淀。在沉淀中加入1mL 0.5%Tween-80,于13,000g,4℃离心30s,清洗一遍。弃去上清之后加入200μL H2O,混匀,将悬浮液转移至先前预冷的离心管中,用TissueLyser-24多样品组织研磨机震荡破碎细胞。15,000g,4℃离心10min。取上层水层约500μL加入等量氯仿/异戊醇(24:1)震荡45s,13,000g,4℃离心10min。轻取水层,加入等量异丙醇溶液,混匀后置于−70℃至少30min。15,000g,4℃离心15min,弃去异丙醇溶液,蒸发剩余溶剂,加入40μL无菌水溶解RNA,−20℃保存。
RNA提取试剂盒法
        取一定量的BCG培养物放置于无菌离心管中,加入1mLPBS,100μL溶菌酶/TE buffer(pH 8.0),涡流混合30s。30℃温育10min。加入350μL buffer BRK,7μL β-巯基乙醇,30mg玻璃粉,剧烈涡流振荡5min,13,000g,4℃离心5min。取上清液400μL加入等量70%乙醇,混合。将混合液上样硅胶柱上,13,000g,4℃离心60s。用RNA Wash buffer 1及RNA Wash buffer 2分别洗涤2次,干燥硅胶柱。40μL DEPC水洗脱硅胶柱上的RNA,−20℃保存。
        从不同干重的BCG中分别用异硫氰酸胍法和RNA提取试剂盒法提取总RNA。1~5mg、6~10mg、20~30mg的BCG中用异硫氰酸胍法分别提取了平均213μg、234μg、148μg的RNA,而用RNA提取试剂盒法提取到得RNA几乎为零。
        随着商业化的发展,国内外许多生物试剂公司研发出了许多RNA提取试剂盒,这些市面上常见的试剂盒主要采用的裂解液为Trizol试剂以及溶菌酶,研究结果表明异硫氰酸胍法用于提取结核分枝杆菌RNA具有明显优势。另外,就成本而言,异硫氰酸胍法明显低于Trizol试剂盒,特别是在需要大批量抽提RNA时,成本优势更为明显。因此,在需要大批量抽提分枝杆菌RNA时,异硫氰酸胍法是一个更好的选择。
参考文献
[1] 俞垭美, 王姗姗, 褚丽花, 等. 适用于结核分枝杆菌RNA 抽提的实验方法学研究. 2016, 21, 609-612.