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NBT |298-83-9| 还原实验及注意事项

2017-4-17

         氯化硝基四氮唑蓝(NBT)是脱氢酶和其它过氧化酶的底物,以及凝血因子I的沉淀试剂。NBT也是碱性磷酸酶底物之一,在碱性磷酸酶的催化下可生成不溶性的蓝色产物。除此之外,NBT也常用于免疫组化(IHC)、免疫细胞化学(ICC)和蛋白印迹(WB)等实验。NBT还原实验是一种常用的用于检查机体细胞免疫功能的方法,本文将对其实验方法和注意事项进行总结。
 
         NBT是水溶性淡黄色活性染料,当其被嗜中性粒细胞的酶还原,可接受氢离子变为非水溶性的蓝黑色甲臜颗粒,呈点状或片状沉淀在中性粒细胞胞浆内有酶活性的部位,因此可在显微镜下观察并计数阳性细胞百分率。当机体受细菌、真菌和寄生虫感染时,嗜中性粒细胞的吞噬能力明显增强,还原NBT的能力亦随之增高,而病毒性感染或非感染性疾病则不增高。
 
具体实验方法如下:
 
         在载玻片上滴加20~30μL肝素溶液;取受试者手指血约40~60μL,与载玻片上的肝素混匀;加入NBT溶液一滴,轻轻吹吸混匀;置于湿盒中,放入37°C恒温箱孵育15min后,转至室温再放置15min,并轻轻摇匀;将载玻片上的待检样本制成血涂片,自然晾干。
 
         瑞氏-吉姆萨染液染色:将载片平放在玻璃板上,将染料滴加到载玻片上,让其均匀覆盖住载片上的血细胞,染色时间约为2~3min。等瑞氏染液有变红的趋势时,迅速滴加等量的PBS溶液,继续染色2~3分钟。染色时间到后,用PBS溶液冲片。冲片结束后将载片放到阴凉处风干。在玻璃板上放好牙签,将风干的载片倒扣在一根牙签上,从背面滴加基姆萨染液进行扣染,染色时间约为10分钟。时间到后用蒸馏水冲片,洗净染液后常温下风干。
 
         镜检:凡中性粒细胞胞浆中含有蓝色甲臜颗粒者为NBT阳性细胞,计数100个中性粒细胞,计算NBT阳性中性粒细胞的百分率。正常人外周血中性粒细胞阳性率约为10%。百分率愈高,表明中性粒细胞的吞噬功能越强。阳性细胞百分率可作为区别细菌性与病毒性感染的指标之一,当机体受细菌感染时,NBT阳性细胞增多,受病毒感染时,NBT反应一般正常。
 
注意事项:
 
1、血液涂片应厚薄均匀,以免影响染色结果:太厚时红细胞容易重叠并易皱,太薄时又不容易找到白细胞;
2、血溶液要干透后才能染色,否则染色时血膜容易脱落;
3、瑞氏-吉姆萨染液不能过少,以防染液蒸发引起染液沉淀;
4、如果染色过淡,可复染,但最好不复染;染色过深可用水冲洗或浸泡,还可用75%的乙醇脱色3~5s再镜检。如果染色过深或过浅,应调整染色时间或工作液的浓度;
5、染色液可重复使用,但不能多次重复,若有沉淀物应过滤后使用。
 
         NBT还原实验可判断机体是否有感染性疾病,以及感染是否为病毒感染。NBT实验是诊断全身性感染的一种辅助方法,并作为判定嗜中性粒细胞杀菌功能的指标,以诊断吞噬功能缺陷症。但是在实验中要留心以上注意事项,方能得到准确的检测结果。同时为了安全和健康,要做好防护措施,穿实验服并戴一次性手套。
 
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