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Tricine-SDS-PAGE胶的配置

         Tricine是一种应用于生物化学和分子生物学的两性离子缓冲剂,pH缓冲范围7.4-8.8。在用SDS-PAGE法分离小分子肽时,通常取代Laemmli缓冲液中的甘氨酸。Tricine胶对于10kd以下的小分子蛋白鉴定表现出优越的性能,而常规的SDS-PAGE用来跑小分子蛋白,会造成模糊不清,胶质过软等问题。下面我们就介绍一种Tricine-SDS-PAGE胶的配置。

试剂:

阳极缓冲液(+): 200 mM Tris pH=8.9

阴极缓冲液(-):100 mM Tris/100 mM Tricine/0.1%SDS

凝胶缓冲液:3.0 M Tris, pH=8.45/0.3% SDS

积层丙烯酰胺:48%丙烯酰胺/1.5%甲叉双丙烯酰胺

分离丙烯酰胺:46.5%丙烯酰胺/1.5%甲叉双丙烯酰胺

样品缓冲液(20 ml:

5 ml 0.5M Tris pH=6.84 ml 20% SDS; 1ml 巯基乙醇;4ml 50% 甘油;0.004 g溴酚蓝;6 ml重蒸水。

分离胶:

15%胶: 2 ml分离丙烯酰胺,2 ml凝胶缓冲液,2 ml 50%甘油。

10%胶: 1.22 ml分离丙烯酰胺,2 ml凝胶缓冲液,2 ml 50%甘油,0.78 ml重蒸水。

75 ul 10%的过硫酸铵(APS)和7.5 ul的四乙基乙二胺(TEMED)进行聚合。

积层胶:

0.25 ml的积层丙烯酰胺,0.75 ml凝胶缓冲液,2 ml 重蒸水,20 ul 10% APS2 ul TEMED

积层胶和分离胶要在同一时间进行聚合,然后将积层胶倒到分离胶上(操作时需要小心快速)。

样品载入和电泳:

对于迷你型胶,每孔5-10 ul就能给出最好结果,样品在孔板中的分层需要非常小心,确保在样品载入前洗掉没有聚合的丙烯酰胺。样品载入完成后,在微凝胶装置中设置25-35 mA的恒定电流进行电泳分析。在跑胶的过程中,阴极顶部会出现泡沫,此时需要额外添加阴极缓冲液。

    上面介绍了一种Tricine-SDS-PAGE胶的配置,以便研究人员参考,但在具体的实验中,还需要根据实际情况,找到适合其研究体系的合适配方。

 

相关链接:Tricine

本文由苏州亚科科技股份有限公司编辑