RNA提取的实验前准备及详细实验步骤

本文转自生信人，原文：生信人和实验狗
本文详细介绍RNA提取的实验前准备及详细实验步骤，对于做克隆和荧光定量的同学们有所帮助！同时要时刻警惕RNA提取也做到无菌操作的水平！
ⅠTrizol法
实验原理
Trizol内含异硫氰酸胍能迅速破碎细胞，同时使核蛋白复合体中的蛋白变性并释放出核酸；由于释放出的DNA和RNA在特定pH值下的溶解度不同，且分别位于中间相和水相，从而使DNA和RNA得到分离；取出水相后，通过有机溶剂(氯仿)抽提及异丙醇沉淀，可得到纯净RNA。
预备实验
1.DEPC简介
DEPC是一种潜在的致癌物质，主要是能生成乙酯基衍生物和乙酯类衍生物，其中尿烷是一种已知的致癌物质。DEPC有刺激性，对眼睛和气道粘膜有强刺激，在操作中应尽量在通风的条件下进行，DEPC毒性并不是很强，但吸入的毒性是最强的，使用时戴口罩，不小心占到手上注意立即冲洗。由于DEPC是一种酯类，较难溶于水，故通过加热搅拌的方式来使其溶解。
2.1%的DEPC水的制备（1L）
取1mlDEPC于999ml去离子水中，37℃在磁力搅拌器上搅拌4h以上使其溶解。此溶液即1%DEPC水。
注意：
①DEPC与水反应后会产生大量的气体，可用塑料膜将瓶口扎紧，剧烈混匀后通过观察塑料膜是否胀气来判断反应是否充分
②DEPC水的量可以根据需要配制即可，原则上确保所有的物品都能浸在DEPC水中。
③制备的1%DEPC水，应留下100ml左右并装入100ml左右的试剂瓶中，以备溶解RNA用。注意：根据试剂瓶的大小调节所留的DEPC水的量，原则是确保DEPC水能够充满整个试剂瓶，并且盛有DEPC水的试剂瓶也要放置过夜，然后高温高压灭菌使DEPC分解后才能用于溶解RNA。
④配制DEPC处理水时用棕色瓶。
3.离心管、各种大小的枪头（1000ul、200/100ul、10ul）根据步骤及提取的量计算所需的个数，然后用制好的1%DEPC浸泡比计算数目略多的过夜处理。
注意①处理方法：用镊子夹住离心管，然后浸入DEPC水中，使离心管中充满液体，然后再倒出，反复2次，最后一次再浸入DEPC水后直接浸入其中，无需倒出。而枪头则用最大量程的枪吸打DEPC水2次，最后一次吸入后不再打出，直接把枪头推至DEPC水中。
②处理完毕后，离心管一般用一培养瓶盛装，枪头用枪头盒盛装，故DEPC处理时也应包含这些器皿。
4.研钵、研棒、试剂瓶、镊子、废液瓶等用锡箔纸包好口后200℃干热灭菌4h。
5.RNA酶的来源。大量的微生物存在于空气中、水中及物体的表面，当它们死亡时，会释放大量的RNAase。对于人的皮肤、粘液、唾液等都因为直接或间接的与空气接触而携带有RNAase。
 
实验步骤

主要参见trizol试剂的说明书，以下步骤仅供参考。
(1)取离心管做好标记，0.2g样品液氮研磨成粉末状，加1mlTrizol，漩涡混匀，室温静置5min。
可提前将离心管放液氮凉一会；一定要将材料研磨充分，且一旦研磨完毕立刻加入Trizol混匀。这一步是能否提出RNA的关键。

(2)加200µl氯仿，上下颠倒15s，室温静置3min。
提前打开冷冻离心机，若在夏季进行实验需开启制冷开关。
(3)12000 r/min 4℃离心15min。
(4)取离心管，样品分三层(无色上清水相，中间白色层，粉色下层有机层)小心吸取无色上清至另一新离心管。
收集上清时应调小枪头（50ul即可），缓慢吸取。
(5)加入等体积异丙醇，轻轻混匀，冰浴10-20min。
这段时间可以用灭菌处理的DEPC水配制75%乙醇。
(6)弃上清，用75%乙醇1ml悬浮沉淀。
(7)12000 r/min 4℃离心10min。
离心之前一定要悬浮沉淀，即指用移液枪将沉淀打起。
 (8)弃上清，再短暂离心，用移液枪将残余的乙醇吸出，沉淀于室温下晾干。
 晾干的标准是无酒精味即可。
 (9)加入30-50µlDEPC处理的水溶解RNA。
 提取完毕后分出2管，其中一管装2ulRNA，用于浓度的测定；另一管装2—5ul，用于电泳检测。浓度测完后根据反转录的要求分装小管，保证每一管符合反转录反应所需的RNA的质量。若用于半定量，则必须保证各样品每管的质量均相同。
（10）电泳时用3%H2O2对电泳整个装置消毒。
（11）取1—2ul进行电泳检测及浓度检测。
（12）分装，-80℃保存。

注意事项
1. 氯仿、异丙醇、乙醇都应用未开封的，75%的乙醇用移液枪配制，勿用量筒等中间器皿。
2. 整个过程要及时更换手套，戴双层口罩，并在操作区开启酒精灯。
3. RNA一定要贮存到-70℃冰箱，在-20℃保存时间很短。
4. 配制的溶液应用灭菌处理的DEPC水。
5. 移液器： RNase的又一污染源是移液器。根据移液器制造商的要求对移液器进行处理。一般情况下采用用DEPC配制的70%乙醇擦洗移液器的内部和外部，基本达到要求。