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AMPPD|122341-56-4|发光性能及其发光免疫分析体系介绍

  文章综述了目前国际上免疫分析中应用的(金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物的结构、发光机理、发光性能和特点以及其免疫分析体系。

关键词 AMPPD(金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物,化学发光免疫分析(CLIA),发光机理,发光性能

     目前,在免疫分析领域中应用多种免疫分析方法,其中化学发光免疫分析 (CLIA)是将免疫反应和化学发光反应相结合,藉以检测抗原或抗体的技术。它是将发光物质或酶标记在抗原或抗体上,免疫反应结束后,加入氧化剂或酶底物而发光,通过测量发射光强度,根据标准曲线测定待测物的浓度。CLIA的主要优点是灵敏度高、标记物有效期长、检测范围宽,可实现全自动化等。CLIA具有强大的生命力,在国际和国内倍受临床用户和生物医学工作者的重视。近十年来 CLIA 的发展迅猛,国外已开发出多种化学发光物质,CLI 2A 系统,以及全自动化化学发光仪。不同的化学发光物质发光机理和发光性能不同,不同的 CLIA 系统原理和方法各异。在众多的化学发光分子当中,12-二氧杂环类是发光效率最高的一类AMPPD 3-( 2-螺旋金刚烷) -4-甲氧基-4-( 3-磷氧酰) -苯基-12-二氧环乙烷作为12-二氧杂环中最具代表性的化学发光分子它的化学发光性质一直是人们研究的热点。本文综述了目前国际上免疫分析中应用的几种( 金钢烷) - 1 , 2 - 二氧乙烷类及其免疫分析体系。

    (金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物能发生化学发光的(金钢烷)-1,2-二氧乙烷,其结构可以表示如下通式:

  其中T通常为环烷烃金钢烷,起稳定过氧环的作用,X为烷氧基,它的作用是增加2-二氧乙烷的水溶性,Y是发光基团(也叫生色基团和荧光发色团)Z Y的保护基团,它与Y连接的化学键能被碱性磷酸酶断裂,而使ZY脱离。当酶促使Z从分子中脱离后,二氧乙烷分解成两个羰基化合物,一个含T,另一个含XY,分解反应放出的能量,使Y激发形成一不稳定的电子激发态中间体,当其回到基态时发出光子。可以通过选择修饰不同取代基Y的二氧乙烷,使发射光的波长和光量子数不同,而通过选择修饰TXZ可改变二氧乙烷的水溶性和分解动力学性质。

    常用于化学发光免疫分析的(金钢烷)-1,2-二氧乙烷有下面几种结构:

在上述分子结构中,螺旋金刚烷构成分子的稳定部分,带有保护基团(磷酸酯或半乳糖吡喃苷)的衍生芳香族结构,则构成易被酶解并在酶解后发光的部分,发光由二氧乙烷断裂分解成为一个激发态的两个羰基化合物。例如AMPPD在碱性磷酸酶(AP)作用下磷酸酯基发生水解,脱去一个磷酸基而得到一个中等稳定的中间体AMPPD-(半衰期2-30min),此中间体经分子内电子转移裂解为一分子的金钢烷酮和一分子处于激发态的间氧苯甲酸甲酯阴离子,当回到基态时发出波长为470nm的光,并可持续几十分钟,其发光机理如下图所示:

  AMPPD的特性:(1)在碱性环境下,AMPPD的非酶解性的水解程度低,即本底低;(2)AMPPD的热稳定性好,在pH=7.0的水中,30时的分解半衰期为142h ,活化能为21.5kcal/mole(3)pH =9.0时,AP酶解AMPPD的速度最快;在pH =9.5时,虽酶解速度略低,但信噪比最低;(4)AMPPD的酶解发光为辉光型,波长为470nm,在15min时强度达到高峰,15- 60min内光信号强度维持一致,变化很小,即使在12h后仍能测定得出正确结果;(5)加入增强剂如聚氯苄乙烯苄基二甲基铵(BDMQ)BSA等,能明显增强AP酶解AMPPD的发光强度,增强因素达100-100000倍。增强剂的增强机理目前还不非常清楚,在理论上还没有精确的解释,文献上一般认为AMPPD在中等极化的非质子有机溶剂(如正丁醇,二甲基亚砜等)中的发光强度和检测灵敏度较在极化的质子溶剂中,尤其是水介质中高。如在水介质中加入增强剂,增强剂包围在 AMPPD 分子的周围,可能通过疏水或离子相互作用或二者兼而有之,与 AMPPD 酶解产生的发色团结合,使发色团形成一个稳定的构。这样使发色团与水分子隔开,从而阻止发色团从激发态回到基态时,非光发射的途径如振动松驰以热能的形式释放全部或部分能量,一些天然的水溶性大分子如水溶性球蛋白BSAHAS等,和人工合成的聚季铵盐如 TMQBDMQ 等,它们的分子结构中都含有疏水区,能提供一个疏水性微环境,具有稳定发色基团的作用,从而增强发光强度。

CSPDCDP-Star是继AMPPD后合成的AP酶解化学发光物质,它们的发光性能优于AMPPD:CSPDCDP - StarAMPPD稳定;非酶解性的水解程度更低; 酶解速度更快,达到最大光信号只需要相当于AMPPD时间的一半;且发光信号更强,信噪比更高;CSPDCDP-Star是目前最理想的AP 酶解化学发光物质。

(金钢烷)-1,2-二氧乙烷及其衍生物应用于CLIA,通常采用的体系是 Dioxetane/ AP/ En 2hance System ,即用碱性磷酸酶(AP)标记抗原或抗体,用 (金钢烷)-1,2-二氧乙烷或其衍生物作发光底物,在发光底物中加入增强剂。目前美国DPC公司的Immulite System Beckman Coulter公司ACCESSÒAutomated Immunoassay System 都是采用Dioxetane/ AP/ Enhance System

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