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IPTG|367-93-1|的诱导研究

摘要:丙基硫代半乳糖苷(IPTG)是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
关键词:IPTG,诱导原理,使用方法,诱导实验,研究
 
前言
 
IPTG,中文品名: 异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷,CAS号: 367-93-1,分 子 式: C9H18O5S,分子量: 238.30,用途:IPTG是β–半乳糖苷酶的活性诱导物质。基于这个特性,当pUC系列的载体DNA(或其他带有lacZ 基因载体DNA)以lacZ 缺失细胞为宿主进行转化时、或用M13噬菌体的载体DNA进行转染时,如果在平板培养基中加入X–gal和IPTG,由于β–半乳糖苷酶的α–互补性,可以根据是否呈现白色菌落(或噬菌斑)而方便地挑选出基因重组体。此外,它还可以作为具有lac或tac等启动子表达载体的表达诱导物使用。
 
1 诱导原理
首先
E.coli的乳糖操纵子(元)含Z、Y及A三个结构基因,分别编码半乳糖苷酶、透酶和乙酰基转移酶,此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节 基因。I基因编码一种阻遏蛋白,后者与O序列结合,使操纵子(元)受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解(代谢)物基因激活蛋白(CAP)结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区,三个酶的编码基因即由同一调控区调节,实现基因产物的协调表 达 。I
其次
在没有乳糖存在时,lac操纵子(元)处于阻遏状态。此时,I序列在PI启动序列操纵下表达的Lac阻遏蛋白与O序列结合,阻碍RNA聚合酶与P序列结 合,抑制转录起动。当有乳糖存在时,lac操纵子(元)即可被诱导。在这个操纵子(元)体系中,真正的诱导剂并非乳糖本身。乳糖进入细胞,经β-半乳糖苷酶催化,转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白,使蛋白构象变化,导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)的作用与异乳糖相同,是一种作用极强的诱导剂,不被细菌代谢而十分稳定,因此被实验室广泛应用。
 
2 IPTG诱导
 
2.1 IPTG的使用方法
 
首先把IPTG配制成23.83 mg/ml(100 mM)的水溶液,并进行过滤除菌后保存。然后在100 ml的琼脂培养基中,加入100 μl的上述溶液、200 μl的X-Gal(20 mg/ml的二甲基甲酰胺(DMF)溶液)和100 μl的Amp(100 mg/ml),制作成IPTG、X-Gal、Amp平板培养基。当DNA片段插入至pUC系列载体(或其他带有lacZ、Amp基因载体),然后转化至lacZ缺失细胞中后,涂布上述的IPTG、X–Gal、Amp平板培养基,可根据长出菌体的蓝白色,而方便地挑选出基因重组体(白色为具有DNA插入片段的基因重组体)。诱导外源基因的表达,普遍应用于原核表达系统,使其表达量增高,产物稳定,具有易鉴定,易纯化的优点。
 
2.2 IPTG诱导实验
 
IPTG诱导浓度对重组李氏溶血素表达的影响
 
        将保留的阳性菌种从一86℃冰箱中取出,划线接种含Amp的LB平板,挑取单个菌落,接种于含有Amp的5 mL LB液体培养基中,37℃振荡培养过夜;取培养过夜的阳性转化子分别按l:l00比例接种于含100 mL的LB培养液的三角瓶中,230r.min-1,37℃培养到OD值等于O.5时,取IPTG诱导前菌液保存。另外分别加入IPTG至终浓度为0.2,0.4,0.6,0.8,1.0,1.2,1.4,1.6 mmo1.L-1诱导2.5 h,同时检测DD咖值,记录。取IPTG诱导前和诱导后时间菌液各l mL,12000 r·min-1离心5min,弃上清获得菌体沉淀,根据检测0D值,加入、1×PBS(OD600x50μL)及等量2×SDS凝胶加样缓冲液(含DTT),充分混匀,煮沸5min。取10μL上样,以蛋白质标准分子量为参考,在分离胶浓度为12%的情况下进行SDS~PAGE电泳分析[1]。利用BandScan软件分析蛋白表达量。并转印到硝酸纤维素膜上,进行Westem_blot分术[2]
 
结论
 
        单核增生性李斯特杆菌是引起食源性疾病的重要细菌和之一,该菌对环境抵抗力极强,在低温(4℃)和高盐(20%)的情况下都能生长良好并产生致病力[3]。当前,在世界各地都有污染食品的报道。所以此细菌越来越受到我国及世界各地科学家的重视。重组李氏溶血素的获得为李氏杆菌的检测和李氏杆菌病诊断开辟了新的途径[4]。本研究通过实验证明在LB液体培养基条件下,l盯G在诱导重组李氏溶血素表达的最佳浓度为0.6 mmo卜L_J,在此基础上增加浓度不会增加表达量。这样,不但节省了工业化生产时的IPTG成本,更减少了IPrrG本身的毒性对基因工程药物应用的影响程度。另外,有许多因素都会影响外李氏溶血素的表达,例如培养液、培养温度、诱导前的菌液0D值等。尚需进一步实验去探索。
 
参考文献
 
[1]卢胜栋.现代分子生物学实验技术[M].2版.北京:中国协和大学出版社,1999.
[2]萨姆布鲁克J,拉塞尔D w.分子克隆实验指南[M].3版.北京:科学出版社,2002.
[3]Palmer M.The family of thiol-activated,cholesteIDl-binding cy-tolysins[J]. Toxicon,200l,39:1681-1689
[4]Low J C,Donachie W.A review of Listeria monocytogenens and listeriosos [J].Vet,1997,153:9-29
 
 

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