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AMPPD|122341-56-4|化学发光磁酶免疫法的检测原理及使用历程

摘要:化学发光磁酶免疫法是将化学发光分析方法、磁性分离技术和酶免疫分析手段三者结合起来的一种新的分析方法。它利用了化学发光分析方法的高灵敏度,磁性分离方法的快速、易自动化及免疫分析方法极高的特异性等特点,在生物分析中具有广阔的应用前景。本文通过一种AMPPD的检测案例,来介绍AMPPD化学发光磁酶免疫法的使用过程。
关键词:AMPPD, 化学发光磁酶免疫法,检测原理,使用历程
 
前言
 
 AMPPD是全自动化学发光免疫分析仪器上使用的关键化学发光底物,能发出强度很高的光信号,目前已广泛用作化学发光免疫分析,具有最高的检测灵敏度、检测结果稳定,重复性好,已在医学上推广使用。但由于其价格较高,限制了其大规模的发展使用。价格高的主要原因是该物质制备较为困难,合成工艺复杂。目前,国内市场大多以进口为主,苏州亚科化学试剂股份有限公司是国内为数不多的自产型供应商。
 
AMPPD化学发光磁酶免疫法检测O157:H7 大肠埃希菌
 
检测原理
 
磁酶免疫检测法是将磁性材料经过化学修饰后,在其表面结合抗体,采用双抗体夹心法,根据标记抗体与相应底物反应而达到待测物的检测目的。本实验直接利用AMPPD新型发光试剂,对O157:H7 大肠埃希菌进行检测,建立了一种新的化学发光磁酶免疫分析方法。发光底物AMPPD在碱性磷酸酶(ALP)的催化下,磷酸酯键发生断裂,分解成AMP-D,所释放出的化学能转化为光能而产生光信号。发光信号的强度与ALP的含量成正比,因此根据检测信号的强度变化即可达到对目标物质定量分析的目的[33,34]。
 
次研究利用表面修饰有氨基的磁性微球经戊二醛活化后,以结合 O157:H7 大肠埃希菌的单克隆抗体 B,使之可以特异性的与 O157:H7 大肠埃希菌进行结合,然后再加入碱性磷酸酶标记的O157:H7 大肠埃希菌单克隆抗体 A,使其与细菌表面的相应抗原进行结合,利用磁性分离将未结合的抗体去除,最后加入发光底物 AMPPD,检测发光强度,利用发光强度的变化对细菌进行定量。
 
方法
 
化学发光磁酶免疫法步骤为,取5µl经计数分析过的O157:H7大肠埃希菌菌液,用TTBS-Casein缓冲液进行倍比稀释使细菌浓度分别达1.0×108、1.0×107、1.0×106、1.0×105、1.0×104、1.0×103、1.0×102、0 个/mL,分别加 30 µL免疫磁珠与 200 µL PBS,混匀,室温放置 30 min;再加 15 µL ALP标记的O157:H7 大肠埃希菌单克隆抗体A,用振荡器充分混匀,室温放置 30 min,然后置于磁性分离器上沉淀 2 min,将管中液体拍出后,用洗涤液 300 µL反复冲洗 3 至 5 次,将残液拍干,加 10 µlAMPPD混匀室温放置 30 min后,检测发光强度。
 
结束语
 
化学发光磁酶免疫分析法是最近几年才发展起来的一种新型分析方法,该法是建立在多学科交叉的基础上,它综合了磁性分离技术,化学发光分析与免疫学方法三种检测手段各自的优点,利用我们自行制备的表面偶联 O157:H7 大肠埃希菌的单克隆抗体的免疫磁珠特异性极强地捕获待测菌,再与 ALP 标记抗体形成磁珠- O157:H7 大肠埃希菌-ALP 标记抗体免疫夹心复合物,最后加入发光底物 AMPPD,产生光信号,利用发光强度的变化实现对 O157:H7 大肠埃希菌的快速、准确和特异的检测。整个分析过程可以在2h内完成,检测限也下降了一个数量级,本方法对仪器要求简单,适合在现场当中应用。将该法与人工计数法两种方法的实验结果进行比较,两法相关性较好。另外,我们认为只要拥有特定致病微生物的单克隆抗体,就可能利用本法实现对待测菌的快速、准确的测定。因此,本次研究不失为微生物快速分析检测当中的良好尝试,为其它致病菌检测提供一种理想的参照方法。
 
参考文献
 
[1] 贺艳峰,化学发光磁酶免疫法检测体系的研究2006.05
 
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