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诱导剂IPTG的浓度是越高越好吗？如何确定最佳浓度？

2017-1-9

IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)是β-半乳糖苷酶底物的类似物，具有极强的诱导性，在IPTG诱导下，诱导物可与阻遏蛋白形成复合物，使阻遏蛋白构象发生改变，从而不能与目的基因结合，进而使目的基因高效表达。那么在实验过程中，IPTG的浓度该如何确定呢？是不是越大越好呢？

首先来了解一下IPTG的诱导原理：E. coli的乳糖操纵子（元）含Z、Y及A三个结构基因，分别编码β-半乳糖苷酶、透性酶和乙酰基转移酶。lacZ将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，或转为别乳糖；lacY使环境中的乳糖透过细胞膜，进入细胞；lacA将乙酰基从乙酰辅酶A上转移到β-半乳糖苷上，涉及到去毒化作用。此外还有一个操纵序列O、一个启动序列P及一个调节基因I。I基因编码是一种阻遏蛋白，能结合于操纵序列位点O上，使操纵子（元）受阻遏而处于关闭状态。在启动序列P上游还有一个分解代谢物基因激活蛋白的结合位点——CAP结合位点。由P序列、O序列和CAP结合位点共同构成lac操纵子的调控区，三个酶的编码基因即由同一调控区调节，实现基因产物的协调表达。

在没有乳糖存在时，lac操纵子（元）处于阻遏状态。此时，I序列在PI启动序列操纵下表达的lac阻遏蛋白与O序列结合，阻碍RNA聚合酶与P序列结合，抑制转录起动；当有乳糖存在时，lac操纵子（元）即可被诱导，在这个操纵子（元）体系中，真正的诱导剂并非乳糖本身，乳糖进入细胞，经β-半乳糖苷酶催化，转变为异乳糖。后者作为一种诱导剂分子结合阻遏蛋白，使蛋白构象变化，导致阻遏蛋白与O序列解离、发生转录。异丙基硫代半乳糖苷（IPTG）的作用与异乳糖相同，是一种作用极强的诱导剂，不被细菌代谢而十分稳定，因此被实验室广泛应用。

如何确定IPTG的最佳使用浓度？以大肠杆菌为例。

将含有阳性重组子pGEX(CGRP/msCT)的大肠杆菌BL21基因工程菌接种于含有50μg·mL⁻¹ Amp的LB液体培养基中，37℃培养过夜。将上述培养物按照1∶100的比例接种于10瓶50mL新鲜的含有50μg·mL⁻¹ Amp的LB液体培养基中进行扩大培养，培养至OD₆₀₀值为0.6～0.8时，分别加入IPTG至终浓度为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6，0.7，0.8，0.9，1.0mmol·L⁻¹。在相同温度、相同时间下进行诱导后，分别从中取1mL菌液，离心收集菌体进行SDS-PAGE分析不同IPTG浓度对蛋白表达量的影响，进而选取蛋白表达量最大的IPTG浓度。

经过实验会发现，IPTG的浓度并不是越大越好。这是由于IPTG对菌体具有一定的毒性，超过浓度也会杀死细胞；而且一般来讲，我们希望细胞内表达的可溶性蛋白越多越好，但是很多时侯IPTG浓度太高会形成大量包涵体，而可溶性蛋白的量反而减少。因此，最合适的IPTG浓度往往不是越大越好，反而浓度较低。

对基因工程菌株进行诱导培养目的在于提高目的蛋白的产量，降低成本。目的基因的表达量除受菌株自身因素和表达质粒的影响外，还受其他外界条件，如诱导物浓度、诱导温度和诱导时间等的影响。所以一般情况下，一个未知的蛋白在表达纯化之前，最好要对诱导时间，温度以及IPTG浓度进行研究，以便选择合适的条件，获得最好的实验结果。