高通量精准相对定量蛋白质糖基化：靶向同步分离裂解多个离子的三级串联质谱结合六通道醛基衍生化试剂首次在N-糖原组学上的应用

本文来自x-mol
糖基化是在糖基转移酶的控制下，蛋白质附加上糖的过程，是一种重要的翻译后修饰。这种修饰对于蛋白质功能调节起着重要作用。研究表明，糖基化在许多疾病和生理过程中都起着关键作用，例如癌症、心脑血管疾病、免疫识别及信号转导过程。然而，糖基化位点上糖型的多样性以及翻译后修饰产物的极低丰度严重阻碍了糖基化的研究进程。在糖基化质谱研究应用中，天然多糖离子化效率较低也给质谱分析带来很大难度。同时，天然多糖通用标准品的缺乏，使多糖的定量分析也一直颇具挑战。美国威斯康星大学的李灵军教授团队通过利用赛默飞六通道aminoxyTMT质谱标记试剂结合Orbitrap Fusion Lumos液质联用，首次实现了靶向同步分离裂解多个离子的三级串联质谱（Targeted MultiNotch MS3）方法在N-糖组学的应用，为蛋白质糖基化研究乃至生命医学和疾病治疗等提供了新的研究方法和手段。

AminoxyTMT是赛默飞公司近年来推出的基于碰撞碎裂二级质谱产生的报告离子强度进行相对定量的六通道醛基衍生化试剂。衍生化可以显著提高多糖在电喷雾过程中的离子化效率，进而提高检测灵敏度；然而实际应用中，对于衍生化后的复杂型多糖和含唾液酸的酸性多糖， aminoxyTMT标记试剂的报告离子在碰撞诱导解离（CID）中生成效率较低，影响了复杂多糖定量的灵敏度和准确性。在液质联用进行复杂的实际样品分析过程中，母离子筛选易受基质的干扰，从而使得碰撞诱导解离二级质谱产生的碎片报告离子不完全来源于同一种母离子，定量结果与真实值存在偏差。为了克服这些局限性，作者利用了所有N-glycan分子的还原端结构中含有(HexNAc)2(Man)3的共性，以及aminxoyTMT衍生化后的糖原分子在碰撞诱导解离后会产生一系列带有aminoxyTMT衍生基团的Y离子，巧妙地设计了同步分离并高能诱导裂解多个Y离子的三级质谱方法来生成用于相对定量的报告离子。这一方法在融合了三种质量分析仪（四极杆、线性离子阱、轨道离子阱）的赛默飞Orbitrap Fusion Lumos质谱仪上得以实现：第一步通过高分辨率的一级轨道离子阱质谱 （Orbitrap-MS）得到精确的母离子分子量，第二步通过四极杆分离目标母离子、线性离子阱中碰撞诱导碎裂二级质谱鉴定糖原单体成分，第三步通过离子阱中多个Y离子同步分离、高能碰撞诱导解离（HCD）、轨道阱检测的三级质谱得到报告分子基团以进行相对强度定量。在液质联用的在线检测过程中，作者利用二级质谱谱图中Y1（HexNAc-aminoxyTMT） 特征离子的存在来判断母离子是否为检测目标的糖原分子，并以此决定是否进一步对此母离子进行三级质谱定量分析：如果MS2碎片离子中出现多糖的特征Y1离子，则利用线性离子阱同步分离出二级质谱产生的强度最高的5个碎片Y离子，并进一步高能碰撞诱导解离（HCD）这些Y离子来生成报告离子进行相对定量。在这个方法中，挑选多个碎片离子同时碎裂 （Multi-notch MS3），既保证了较高的报告离子强度，有利于对低丰度物种的定量分析，又降低了基质对母离子筛选产生的干扰，使得定量结果显著优于传统MS2方法。这一巧妙的设计，克服了aminoxyTMT在复杂多糖分析中报告离子生成的不足，提高了在线检测获得的有意义的图谱数量, 多糖的鉴定数，定量的准确性以及低丰度多糖定量分析的效率。

该文章同时就MultiNotch MS3的定量方法与传统HCD-MS2、以及标准MS3定量方法进行了比较。结果显示HCD-MS2 NCE 30能量的条件下报告离子生成效率低，定量结果与理论值也相距甚远；在提高能量到HCD NCE 70之后，MS2方法可以产生足够的报告离子，但是多糖的骨架碎片几乎全部消失，不利于多糖的结构鉴定。虽然标准MS3方法通过碎裂CID-MS2产生的Y1 离子可以得到丰富的报告离子与准确的定量结果，但是MultiNotch MS3定量方法可以通过筛选强度最高的5个Y离子进行再一次碎裂，获得高于标准MS3方法近九倍的报告离子强度，更准确的定量结果与更小的标准差，对于复杂多糖的分析，优势更为明显。文章最后，作者将MultiNotch MS3方法应用于牛甲状腺球蛋白与人血清蛋白多糖相对定量分析中，发现数种多糖在不同蛋白中的含量有较大差异，同时进一步验证了MultiNotch MS3定量分析结合aminoxyTMT可以提高低丰度多糖的定量效率。作者预见，随着高端质谱仪的普及，MultiNotch MS3的高通量相对定量方法在糖原组学分析领域和疾病生物标记物检测领域将会得到更广泛的应用。

这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生陈冰茗（现就职于默沙东公司）和博士后钟雪飞（现就职于华盛顿大学），通讯作者为李灵军教授。

该论文作者为：Bingming Chen, Xuefei Zhong, Yu Feng, Sergei Snovida, Meng Xu, John Rogers, Lingjun Li

Targeted MultiNotch MS3 Approach for Relative Quantification of N-Glycans Using Multiplexed Carbonyl-Reactive Isobaric Tags
Anal. Chem., 2018, 90, 1129–1135, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b03289