NEWOMICS新型离子源MnESI为冷冻电镜前筛选蛋白样本提供高通量，高灵敏度和稳定性的LC-MS方案

本文转自BioArt
Native mass spectrometry (MS)非变性质谱可以保持生物分子的自然折叠状态和相关的非共价相互作用，是研究完整蛋白质、大分子蛋白质复合物、蛋白质-蛋白质、蛋白质-配体相互作用的强大技术。
非变性质谱依赖静态纳米电喷雾质谱(nanoESI-MS)方法能达到较高的灵敏度，但其重现性和稳定性低且有复杂的样本前处理。然而，传统的LC-MS分析方法难以达到高灵敏度的效果。
为了应对这些挑战，本文开发了一个新的微流-纳米电喷雾-质谱(MnESI-MS)平台，该平台由MnESI离子源和M3发射器组成，可与超高分辨质谱仪联用，实现大分子蛋白质的高灵敏度、高通量和高稳定性的LC-MS分析，同时保持其天然状态。
实验方法
对比静态纳米电喷雾法、新型微流-纳米电喷雾LC-MS法和传统HESI的LC-MS法三种方法，使用GroEL、r20S和t20S蛋白酶体作为模型复合物进行分析实验，并展示了新型微流-纳米电喷雾LC-MS在冷冻电镜样品筛选中的应用。

结果1三种方法都良好保持了天然蛋白的电荷状态，且测得的相对质量符合预期。但微流液相色谱-质谱的信号强度比HESI的液相色谱-质谱高4.8倍。且MnESI-MS采用了1：10柱后分流技术使得进入M3喷针的样本比HESI的液相色谱-质谱少了10倍。而MnESI-MS的信噪比却是HESI的液相色谱-质谱的11.1倍。
良好信噪比和信号强度的增强，使得MnESI-MS比传统HESI方法灵敏度提高了近50倍，且非常低的上样量减少了仪器的污染，增强方法的稳健性。
与传统的静态纳米电喷雾质谱技术（nanoESI-MS） (图3d)相比，微流的MnESI平台(图3b)提供了类似的灵敏度和数据质量。

MnESI平台能够以自动化高通量方式实现对生物分子的分析，且能达到静态纳米电喷雾质谱无法实现的液相色谱分离。质谱前的在线液相色谱分离对于分析混合物中不稳定的蛋白质复合物至关重要，而且少于20分钟的梯度时间，在分析天然完整蛋白质和蛋白质复合物时具有更高的样品通量和分析鲁棒性，同时保持了灵敏度和数据质量。

结果2
在分析不稳定性蛋白复合物时MnESI平台获得了与nanoESI-MS方法相当的灵敏度和MS1数据，且提供了更高的样品通量。

结果3
在对蛋白冷冻电镜分析之前需要了解样品的质量。在本研究中使用MnESI平台高通量筛选不同生物缓冲液中的20S蛋白酶复合物以确定冷冻电镜的最佳条件。从样品稳定性、样品均一性以及颗粒密度和分布等关键属性来评估冷冻电镜的最佳结果。最终HEPES 缓冲液被证实是最佳的冷冻电镜条件。此实验证实了MnESI平台可以被用来高通量的筛选将要冷冻电镜分析的样本。

结论
微流纳米喷雾电喷雾(MnESI)平台将微流液相色谱与纳流电喷雾器与质谱无缝连接，用于蛋白质和不稳定蛋白质复合物的非变性质谱研究，且具有更高的灵敏度和稳定性。

MnESI平台支持的microflow SEC-LC/MS方法实现了与传统静态纳米电喷雾质谱分析相当的数据质量，且具有更高的样品通量、重现性和稳定性等特点。