DNA、RNA提取总结及注意事项

本文转自生信人，本文源自生信人与实验狗公众号
提取一种核酸时，首先应该查阅文献，了解是否有前人尝试此种物种核酸的提取方法，若有则可以参照其方法进行提取，否则应首先了解此种植物含糖类、酚类、次生代谢物等物质的多少，然后制定相应提取方案，以实现最大程度的去除这些物质。提取核酸材料选择是至关重要的。新鲜幼嫩的组织往往糖类、酚类、次生代谢物等杂质含量少，因此提取的核酸质量（纯度）会较高，对后续的PCR、酶切等反应有利，而老的组织由于各种杂质含量都较高，因而不易获得纯净的核酸，影响后续的各种酶促反应。
关于破碎细胞。破碎细胞一般是采用研磨法。在研磨之前将材料剪成小块，可以直接研磨也可以用液氮研磨（但提RNA必须用液氮研磨），将组织磨成匀浆即可。在这里对冷冻的材料特别要求从冰箱中取出后要迅速称量，然后研磨，在提RNA时要保证材料在液氮研磨之前不能融化。
关于称取样品质量。根据提取量的要求，选择一次研磨的质量，然后平均分至各管中（后面的步骤均为提一管所需的各试剂的量）。
酚/氯仿/异戊醇在抽提过程中的作用。酚对蛋白质的变性作用远大于氯仿，但是酚的比重略比水重，碰到高浓度的盐溶液，离心后酚相会跑到上层，不利于含质粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始终在下层，方便水相的回收；另外酚与水有很大的互溶性，如果单独用酚抽提后仍有大量的酚溶解到水相中，其会抑制后续的酶促反应（比如限制性酶切反应），因此单独用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次将水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液进行抽提，跑到水相中的酚则少得多，但最好再用氯仿抽提一次，将酚完全除去。异戊醇，其作用主要是为了让离心后上下层的界面更加清晰，方便水相的回收。另外在一次酚/氯仿抽提之后，上清液仍然呈现较深的颜色，则可以考虑再次进行酚/氯仿抽提。因为在植物中存在各种色素，主要包括脂溶性色素与水溶性色素两类。脂溶性色素多为四萜类衍生物，主要有叶绿素、叶黄素、胡萝卜素、番红花素和辣椒红素等，它们易溶于乙醇，酚和氯仿等溶剂。其中胡萝卜素不溶于乙醇。水溶性色素主要为花色甙类，又称花青素，普遍存在于花中。可溶于水与乙醇，不溶于乙醚与氯仿等有机溶剂。因此一般可以通过再次酚/氯仿抽提将色素除去。
对于沉淀核酸方法的讨论。沉淀核酸主要通过有机溶剂法沉淀，原理主要是降低了介电常数，破坏了了核酸分子表面的水化层。另外还可以利用等电点法和盐析法沉淀，如利用醋酸钠（3M，pH5.2），一方面高盐浓度破坏核酸分子水化层另一方面使其接近核酸等电点。（核酸的等电点比较低。如DNA的等电点为4～4.5，RNA的等电点为2～2.5）。常用的有机溶剂是乙醇和异丙醇，它们的区别是：沉淀DNA 通常使用冰乙醇,在低温条件下放置时间稍长即可使DNA沉淀完全。而沉淀RNA通常使用异丙醇。异丙醇沉淀速度快但通常把盐分也沉淀下来。在使用量上，乙醇终浓度为70%即之前的溶液中加入2—2.5倍体积的无水乙醇，使其浓度达到70%左右，而异丙醇一般使用等体积的量。之后的70%乙醇起到洗涤和再次沉淀的作用。
关于沉淀结束后的操作。沉淀结束后，若沉淀量较大，可以考虑用枪头或灭菌牙签等将沉淀“钩出”，放入新的离心管中，然后用70%乙醇洗涤；若沉淀量较少，沉淀结束后可以将无水乙醇最大量的吸出然后离心。这样可以明显减少提取核酸中盐分、糖类等杂质的含量。
关于乙醇洗涤。常用70%浓度可以有效去除盐离子另外可以洗涤两次，效果会更好。洗涤完成后，必须要晾干，才能进行溶解，防止残留乙醇影响后续的酶促反应。
关于溶解核酸溶剂的选择。当想长期保存，暂时不进行下一步实验时，采用TE缓冲液，其中的Tris-HCl的提供一种缓冲系统，EDTA可以螯合二价金属离子进而抑制依赖于二价金属离子的DNA酶的活性，对DNA起到保护作用。