血红蛋白测定方法

【原理】高铁氰化钾能使血红蛋白中的二价铁氧化成三价铁，形成高铁血红蛋白（Hi）。后者再与氰离子结合，形成稳定的氰化高铁血红蛋白（HiCN）。氰化高铁血红蛋白的最大吸收峰在波长540nm处，可用标准的高精度的分光光度计定量测定，其吸光度与血红蛋白浓度成正比。

【试剂】氰化高铁血红蛋白(HiCN)转化液：

氰化钾（KCN）                         0.05g

高铁氰化[K3Fe（CN）6]                  0.20g

非离子表面活性剂（Triton X-100）     1.0ml

无水磷酸二氢钾（KH2PO4）              0.14g

蒸馏水加至                           1000ml(纠正pH至7.0～7.4)

血红蛋白转化液为淡黄色透明溶液，配成后用滤纸过滤，置棕色瓶中，在室温中可保存数月，在冰箱中稳定时间更长，但勿使结冰。该液以H2O为空白，于540nm测其吸光度应＜0.001。

【器材与仪器】试管、刻度吸管、微量吸管、分光光度计。

【操作】

1.血红蛋白转化   用微量吸管取末梢血24ml，加入5ml HiCN转化液另，充分混匀，静置5min，使充分反应。

2.比色  如果使光光度计比色，波长540nm，光径 1.0cm，以转化液或蒸馏水为空白，测定样本吸光度（A）

3.计算  如果使用符合WHO标准的分光光度计，可根据样本吸光度值（A）直接计算出血红蛋白浓度。

计算公式为：

式中：64458是国际公认的血红蛋白分子量，64458mg/L即为1mmol/L血红蛋白的物质浓度，除以1000换算为g/L。

44是1mmol/L血红蛋白在1.00cm光径，l540nm条件下的吸光系数。

251是稀释倍数。

4.当使用的分光光度计不符合WHO标准时，可先使用已知浓度的血红蛋白标准液制作，HiCN的标准曲线，然后根据样本吸光度在标准曲线上查取血红蛋白浓度。

【注意事项】

1.使用光电比色计之前须校正仪器。

2.采血用的血红蛋白吸管20ml的准确性±1%以内，5.0ml移液管的准确性应在±0.5%以内。当使用标准曲线时，应定期对标准曲线进行校正。

3.样吕在读数前应清晰，如发生混蚀，可能有以下几种情况：

（1）血中白细胞过多，可离心后取上清比色。

（2）血中有异常球蛋白，可在溶液中加0.1g碳酸钾。

（3）有硫化血红蛋白或血红蛋白C时，则可用蒸馏水按1：1稀释，结果乘以2即可。

（4）氰化试剂是剧毒品，在配试剂时要严格按剧毒品操作。如发现变绿、弯混则不能使用，pH低于7.0时应进行调整。

 4.血红蛋白转化液不能贮存在塑料瓶中，否则CN-浓度下降，致使结果偏低。

【参考值】成年男性    120～160g/L

          成年女性    110～150g/L

          新 生 儿    170～200g/L

【临床意义】血红蛋白减少和增多临床意义与红细胞计数相似。但在某些贫血时，由于红细胞平均血红蛋白含量不同，红细胞和血红蛋白减少程度可不一致，如小细胞低色素贫血时，血红蛋白减少比红细胞减少更为显著，而大细胞性贫血时红细胞的减少比血红蛋白减少为显著。因些同时测定红细胞和血红蛋白，对贫血类型的鉴别有重要意义。