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计时电位法测定乙酰胆碱酯酶活性
2019-07-17
来源：亚科官网
乙酰胆碱酯酶(AChE)是与神经功能相关的一种酶，在医学上，血液胆碱酯酶活性测定是急性有机磷农药中毒诊断和疗效观察的重要参考指标。目前，测定胆碱酯酶活性的常用方法是比色法(Ellman法)该法从样品处理到完成测定大致需要60~90min，分析速度较慢，因此，研究快速测定乙酰胆碱酯酶活性的方法非常必要。
仪器与试剂
LK98A-微机电化学分析系统；XW-80A旋涡混合器；SYC-15超级恒温水浴；恒温电解池(自制)；电极：铂对电极，饱和甘汞电极。
乙酰胆碱酯酶(EC3.1.1.7，VI-S型，来自电鳗，500U/mg，Sigma)；底物：碘化乙酰硫代胆碱（别名：碘化硫代乙酰胆碱，cas:1866-15-5，亚科货号：D0007），使用时用0.1mol/L，PH7.4的Tris-HCl缓冲液配成0.002mol/L的溶液，4℃下保存。水为二次蒸馏水。
实验方法
1、测定条件
档位选择：恒电流；灵敏度选择:10mA；滤波参数:10~Z；阶跃电流：0.020mA；放大倍率：1；采样点数：8000；采样间隔：320ms；水浴温度:26℃
2、实验步骤
移取8.0mL底物溶液于恒温电解池中，搅拌平衡5min。加入一定量的AChE，在上述条件下进行电解9记录Et曲线，测量Et曲线上突跃部分的斜率△E/△t。
实验原理
以碘化乙酰硫代胆碱作底物，向电解池的两支铂电极上施加一个恒定的微电流进行电解。因底物中的I-被氧化为I2而获得一个稳定的电位(约0.45V)。当加入乙酰胆碱酯酶时，由于酶促水解所产生的硫醇比底物具有更大的电活性，能在较低电位下(约0.25V)氧化，于是形成电位的降落。记录电解过程中电位E随时间t的变化值，得到一条典型的S型曲线。该去极化曲线的斜率dE/dt反映了水解速率，即酶的催化速率。在一定条件下，酶活性越强，酶促反应越快，去极化曲线的斜率dE/d越大。因此，利用校准曲线可计算待测酶的活性。
活力校准曲线
在上述确定的最佳条件下，加入不同量(0.02U、0.03U、0.04U、0.05U、0.06U)的商品AChE，分别测定其△E/△t值对数据进行线性回归，所得直线方程为Y=-0.3236+35.59X，其相关系数r=0.9920。E~t曲线上突跃部分的斜率值△E/△t与酶量之间存在着良好的线性关系。利用校准曲线可对样品进行测定。
固定化酶片活性的测定
采用戊二醛交联法将AChE固定到商品载体膜上，制成固定化酶片，在上述确定的最佳条件下测定，不同酶用量时的酶片活性，结果见表1
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由表1 数据可见，采用电化学计时电位法测定固定化乙酰胆碱酯酶活性，方法稳定、可靠。
结 论
采用电化学计时电位法测定乙酰胆碱酯酶的活性，酶量与其活性值△E/△t之间呈良好的线性关系，对固定化乙酰胆碱酯酶片获得了满意的测定结果。与其他方法相比，该法简便、快速、重现性好。
相关链接：碘化乙酰硫代胆碱
本文由苏州亚科科技股份有限公司编辑
