慢病毒载体的上游生物处理

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       慢病毒(LV)通常用于细胞和基因治疗，作为载体将基因转移和整合到受体细胞中，以获得治疗效益。LV能够转导分裂和非分裂细胞，如神经元、造血干细胞和免疫系统的细胞，特别是T细胞，传递高达11kb大小的基因。LV是治疗单基因疾病和需要基因传递的过继细胞治疗试验的主要载体。
      随着对慢病毒载体疗法的持续关注，对高效LV生物处理的需求正在增长。大规模生产过程中存在生物工艺无法在上游产生足够的滴度的挑战，再加上下游加工过程中的回收率普遍较低，导致无法提供足够的产量来满足大规模的需求。对于已建立的平台，生产细胞系可能很有价值，其中细胞批量地表达与载体生成相关的所有组件，由于缺乏质粒DNA和所需的转染步骤，此类细胞系在理论上具有良好的商业特性。一旦优化设计了的上游和下游的生产环节，并开发用于快速转基因交换和验证的平台的可行性就很高，此举可能有利于高效的载体生产。

▲ （慢病毒载体结构）
慢病毒载体的生物处理
      慢病毒载体具有独特的理化性质。LV通常基于HIV-1并具有许多共同特征，例如直径为80-120nm的球形、衣壳核心和具有源自宿主细胞膜的包膜的功能酶。LV固有的复杂性和敏感性在加工过程中带来了挑战，例如热稳定性（在37°C下的半衰期为7-8小时）、对需要快速加工的冻融循环的敏感性、盐浓度、pH、剪切力和缓冲渗透压。由于未包装的载体或酶功能丧失或包膜蛋白受损/缺失而导致的转导能力丧失，可能与功能性载体一起共同纯化，从而降低了处理能力。此外，生产细胞类型及其在生产过程中的活性与载体稳定性有关，因此必须保持细胞健康以实现高产量。
       LV处理的要求因应用而异，但高滴度和纯度是最重要的、通用的标准。载体生产中的大多数杂质是残留的DNA、转染试剂、宿主细胞蛋白和培养基成分。对于最终产品是转导细胞的细胞疗法，由于产品释放的质量保证/质量控制(QA/QC)要求位于细胞阶段，因此载体的纯度概况不如体内疗法严格。对于体内疗法，要求则与载体本身的特性有关。
       生产规模取决于预期患者的数量、需要转导的细胞数量以及适合的感染复数(MOI)，包括重复剂量、效力、疾病以及递送方式。理想情况下，MOI应保持较低，以确保单一转基因整合，以限制细胞毒性和致瘤性的风险。
慢病毒载体的上游生物处理
      上游处理的重点是大批量生产LV，同时允许高效的下游纯化。有几个重要的因素需要管理，它们依赖于生产模式，要么通过质粒瞬时转染细胞，要么使用稳定或可诱导的生产细胞系。一个基本因素是细胞的扩增，它们的活性和实现最佳LV生成的合适细胞密度。因此，细胞系的类型（贴壁或悬浮）、用于扩增的生物反应器、适当补充的细胞培养基类型以及瞬时转染方法（如果适用）是需要考虑的重要因素。
用于 LV 生产的细胞系
      需要合适的细胞系来生产高滴度的LV颗粒。通常，选择的细胞系是人胚胎肾细胞293(HEK-293)，特别是衍生的293T细胞系。HEK-293Ts具有SV40T抗原，它与抑制p53和阻止细胞内先天免疫反应的激活有关，并且已被证明可以提高LV的滴度。后一种细胞系比其前体细胞系显示出一些优势，特别是更短的倍增时间、更高的转染效率和更高的载体滴度以及对悬浮培养的适应性。细胞密集培养的能力对于高载体滴度非常有益，因为每个单元理论上是LV的一个生产单元。然而，这需要在整个过程方面进行一定程度的优化，因为高细胞密度与较低的细胞活性相关，这将有助于在加工过程中去除更多的污染物。这一警告可能会否定更多细胞数量提供的任何滴定效用。

▲ （生产过程示意图）

瞬时转染、稳定表达和诱导生产
      主流的LV生产模式是用多种质粒瞬时转染细胞以进行LV表达和组装。该方法最初是为了最大限度地降低复制能力载体的风险而开发的，经过不断发展以提高产量和安全性。残留质粒DNA和转染试剂的污染需要特别关注。由于转染剂的细胞毒性问题，转染后的培养基更换通常是必须的，除了增加总培养基消耗外，还需要额外的泵和罐设备来混合质粒DNA、转染试剂和培养基。此外，许多因素会影响转染效率，包括质粒浓度、试剂、DNA比率、细胞密度、孵育时间、混合方案、温度和pH值，其中一些在放大时具有挑战性。因此，规模放大批次间的差异是显而易见的。临床级质粒和转染试剂的成本增加了生产运行的大量费用，通常每百万个细胞至少使用1µg质粒DNA。
       转染试剂极大地影响生产运行的加工步骤和商品成本。磷酸钙(CaPi)是一种经济的转染试剂，通常用于实验室或小规模放大，需要将氯化钙和DNA与HEPES缓冲盐水混合后，形成磷酸钙和DNA的细沉淀。沉淀物沉降并被细胞内吞。然而，由于混合两种缓冲液易产生大量沉淀物，这种方法难以规模化——需要优化的成分浓度、温度和聚集时间等变量。由于pH值的微小变化会对转染效率产生负面影响，且CaPi转染可能在细胞中引起细胞毒性，而细胞培养物中没有血清或白蛋白的保护作用，所以转染试剂的选择需要结合应用慎重考虑。
       通常，生产或包装细胞面临的最大挑战是在保持高滴度的同时控制细胞毒性或细胞抑制效应。虽然这可以通过诱导系统缓解并且已经通过LV完成，但这些方法目前并不完全实用。Tet-on诱导需要添加四环素，而四环素必须在以后去除，而tet-off诱导可能需要延长培养时间以使表达达到峰值以及需要完整的培养基交换，这可能是不经济的。在所有可诱导的情况下，“泄漏”表达的风险也很明显，因为LV的非控制性生产是可能的。
      尽管如此，随着进一步的发展，稳定生产的应用将对LV的生产大有裨益。除了改进的包装设计、包膜选择和细胞系开发之外，此类改进还可以是高通量自动克隆分离和评估的形式。优化 LV 生产的策略可能是上调抗凋亡基因、下调细胞内传传质并优化蛋白质和脂质生成途径以实现有效的载体生产。

       培养生产慢病毒载体为了产生高滴度的LV，需要大量的细胞。根据不同规模的培养方式，有多种解决方案可以增加LV的生产细胞数量。在开发过程中，需要小批量灵活生产，并且通常以贴壁培养为主，这主要是因为HEK-293T具有天生的贴壁性、提供的高细胞密度和易于获取。随着规模扩大，需要更大和更一致的批量生产，此时生产过渡到搅拌罐、培养袋和固定床生物反应器等形式的生物反应器。许多上游培养容器也已转变为一次性用品。这些不仅有助于减少转换时间，而且还通过减少设备的清洁和灭菌阶段来帮助验证。

▲ （载体表达）
       细胞介质和补充剂培养基的选择与生产细胞的扩增和活性以及下游加工过程中的成功直接相关。因为培养基负责载体的稳定性并形成初始载体，许多LV生产策略使用血清来帮助优化细胞生长和保持载体本身的稳定性，这似乎得益于高蛋白溶液，可能是由于白蛋白和脂质相关的稳定性。高蛋白负荷增加了必须去除大部分血清污染物的下游工艺的压力。基于此，使用无血清培养基进行细胞培养，不失为一种更好的策略。补充细胞培养物与改善LV滴度有关。添加丁酸钠与改善重组蛋白生产有关，通过抑制组蛋白脱乙酰酶，从而改善转录因子功能导致病毒LTR的RNA拷贝增加并改善LV滴度。额外补充胆固醇和脂质与改善滴度有关。由于转染后细胞培养基中存在咖啡因，因此产量有所提高。此外，据报道，在收获前将pH值降低到6会导致滴度增加三倍。高细胞培养基渗透压与通过降低病毒膜中胆固醇与磷脂的比率来改善逆转录病毒稳定性有关。

总结
       在可预见的未来，随着细胞和基因疗法的技术不断发展并转化到临床中，新的应用正在探索中：例如作为病毒疫苗载体。尽管目前全球LV的制造能力很低，但对LV的需求依然保持高位，并且LV生物工艺需要优化，但提高产量和回收率的努力是显而易见的。这些发展将导致更多地反哺细胞和基因疗法以改善治疗结果。