Cell Discovery | 黄鹏羽团队开发CPA-seq鉴定携带修饰的小RNA

本文转自BioArt
工欲善其事必先利其器，黄鹏羽课题组开发的CPA-seq作为检测小RNA的“利器”，打破了我们对传统小RNA的认知。CPA-seq发现，哺乳动物细胞中，除了miRNA、piRNA等传统认为小RNA的主要组成类型以外，还广泛存在大量tsRNA、rsRNA、snsRNA、snosRNA等其他类型的小RNA。这些小RNA广泛存在末端修饰或碱基修饰，因此无法被传统的小RNA测序方法所捕获。该研究也首次系统分析了小RNA的甲基化谱，填补了小RNA修饰领域的空白。这项研究还发现，大量小RNA具有组织特异性表达特征，其中有些小RNA对细胞命运维持与转化具有调控作用。这项研究大大扩展了人们对小RNA种类的认知，并为检测这些小RNA提供了可靠的工具。

长度小于50个核苷酸的短链小RNA主要包括miRNA、piRNA，以及来源于tRNA、rRNA等RNA的衍生物。小RNA对细胞的代谢、增殖、发育等生命活动的维持发挥着重要作用，几乎涉及所有的生物学过程。小RNA的异常表达会导致发育异常、肥胖、癌症等多种疾病的发生【1,2】。

然而传统小RNA建库技术的固化严重阻碍了该领域的深入研究。目前常用的高通量小RNA文库构建策略基于小RNA的5´端为单磷酸基团（5´-P），3´端是羟基（3´-OH）的特点，将其与5´接头和3´接头连接，随后通过逆转录和PCR扩增，建立小RNA文库。然而，最近的研究结果表明，许多小RNA存在多种修饰如：5´端存在5´-羟基（5´-OH）、5´-甲基鸟苷帽子（5´-Cap）、5´-三磷酸 (5´-ppp)、5´-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（5´-NAD+）等修饰；3´端存在2-OMe、3´-磷酸（3´-P）、2´，3´-环磷酸（3´-cP）、3´-氨酰（3´-aa）等修饰；内部存在m1A、m1G、m7G、m3C等甲基化修饰3-5。小RNA末端的修饰会阻碍小RNA与5´接头和3´接头的连接，内部的碱基修饰会阻碍逆转录的进行。此外，基于“小RNA与接头连接”的建库策略会导致对不同种类的小RNA存在偏好性，因此目前不同的小RNA建库策略获得的小RNA测序结果不完全相同。

2021年4月19日，黄鹏羽课题组在Cell Discovery杂志上发表了题为CPA-seq reveals small ncRNAs with methylated nucleosides and diverse termini的研究论文，开发了全新的小RNA测序方法CPA-seq。

图1. CPA-seq流程图

CPA-seq通过Tris-HCl（去除3´-aa）Cap-Clip酸性焦磷酸酶（去除5´-ppp和5´-Cap）、T4多核苷酸激酶（去除5´-OH，3´-P和3´-cP）和AlkB/AlkB（D135S）（去除m1A、m1G和m3C）对小RNA进行去修饰化处理，并采用了TGIRT-III进行逆转录，以提高对存在高级结构的小RNA的逆转录效率（如图1）。CPA-seq解决了目前小RNA建库测序领域三个亟待解决的重要问题：第一能够对携带末端和内部修饰的小RNA进行建库；第二对不同种类的小RNA有较低的偏好性；第三是实现了对小RNA序列上甲基化修饰位点的鉴定能达到单碱基分辨率。

研究人员利用CPA-seq在HEK293T细胞中定量检测了到大量过去传统方法无法检测到的小RNA，包括tsRNA、rsRNA、snsRNA、snosRNA、lncsRNA以及mRNA来源的sRNAs，并分析了这些小RNA的末端修饰类型。同时该研究还首次绘制了HEK293T细胞中小RNA的甲基化修饰谱，填补了小RNA修饰领域的空白。此外，研究人员进一步对九种小鼠组织进行了CPA-seq，发现除miRNA外，mito tsRNA、snsRNA、snosRNA、lncsRNA也具有组织特异性表达特征。并且在细胞命运转化过程中，小RNA表达谱也相应地发生了重编程。

值得一提的是，近日陈琦与合作团队在Nature Cell Biology杂志上发表了文章PANDORA-seq expands the repertoire of regulatory small RNAs by overcoming RNA modifications，建立了一套新的小RNA测序及分析流程PANDORA-seq【6】。该研究中AlkB与T4PNK联用的策略与CPA-seq中的部分策略相互辅证，搬开了小RNA 研究路上的绊脚石（详见BioArt报道：Nat Cell Biol | PANDORA-seq: 打开小RNA世界的潘多拉魔盒）。

上海科技大学生命学院黄鹏羽研究员（现为中国医学科学院生物医学工程研究所研究员）、免疫化学研究所石硕助理研究员为该论文共同通讯作者。上海科技大学2018级博士研究生王鹤鸣、2019级博士研究生黄荣以及工程师李玲为论文共同第一作者。上海科技大学为第一完成单位。