打破液体活检不准偏见！全国独家超微量纳米核酸捕获系统拓荒百亿新蓝海！

本文转自病理柳叶刀
目前，恶性肿瘤是严重威胁人类健康的重要原因之一，给社会带来了沉重的经济负担。随着人口老龄化，肿瘤防治领域面临越来越严峻的挑战。
2019年1月，我国发布了中国癌症统计报告——《2015年中国恶性肿瘤流行情况分析》数据显示，我国2015年有新发恶性肿瘤病例392.9万平均每分钟有7.5个人被确诊为癌症。每年恶性肿瘤所致的医疗花费超过2200亿元。
大部分早期恶性肿瘤通过根治性手术即可得到有效的治疗。当肿瘤在患者体内仅发生微小转移灶，但仍未被临床影像学检查发现的情况下，仍然有50%的患者可通过全身系统性治疗（如化疗、免疫治疗等）达到治愈。
一旦恶性肿瘤患者发生了临床明确的转移，将难以被治愈，患者的生存期也将大幅缩短。以肺癌为例，Ⅰ期的非小细胞肺癌患者5年生存率为70%，而Ⅳ期患者的5年生存率则低于5%。
可见，癌症的早期发现和早期治疗将直接降低癌症患者的死亡率、提高患者的生存期。目前的多数癌症筛查方式只能针对单一癌种，如果对多个癌症进行筛查需要逐一完成多项检查；同时，部分筛查方式有侵入性、操作繁琐、预约周期长等情况，导致实际进行全身肿瘤筛查的人群比例较低，为推动癌症的早期诊断和筛查工作带来了困难，因此临床急需精准便捷的肿瘤早筛技术。

液体活检

据了解，目前我国肿瘤检测方法主要分为传统检测和基因检测两种，涵盖血清肿瘤标记物、医学影像学检查、组织活检、液体活检等方式，而对肿瘤早期诊断最有效的方法是通过体外诊断寻找体液中的肿瘤标志物——液体活检。

液体活检作为体外诊断的重要分支，通过捕获和检测体液（如：血液、尿液、唾液、腹水、胸膜积液等）中的生物标记物（如：血清肿瘤标志物、循环肿瘤细胞（CTC）、循环游离肿瘤DNA（ctDNA）、外泌体等）来诊断和监测肿瘤等疾病。

相较于组织活检，液体活检的优势在于非介入性、可重复性地获得肿瘤样本，其副作用小、操作简便、成本较低、检测速度快，在减小了肿瘤异质性对诊断造成的偏差的同时，也能及时地反应肿瘤发展的动态变化，其临床适应症也极为广泛，如常见的肺癌、乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、食管癌、胃癌、肝癌、胰腺癌等肿瘤均可用液体活检进行诊断与监测。

液体活检相较于传统的组织活检以及医学影像学等手段，能够提前发现尚处于早期的肿瘤，为肿瘤的早筛早诊提供了极具潜力的途径。基于液体活检技术的肿瘤早筛早诊是目前国际肿瘤领域研究集中攻克的热点和难点。JP摩根将液体活检分为早期筛查、诊断分型、药物伴随检测、患者病情检测4个细分领域，预计全球市场潜力达千亿元。

液体活检肿瘤生物标志物

（一）CTC

循环肿瘤细胞（Circulating Tumor Cell, CTC），是指从实体瘤中脱离出来并进入外周血液循环的肿瘤细胞。CTC数目往往很少，而血液中血细胞的数量则非常庞大，要想检测CTC，关键在于根据CTC的物理学特征（大小、密度、电荷、可变形性）和生物学特征（表面抗原、侵袭性等），来实现CTC从血液中的识别和富集。CTC的富集和后续分析，目前还很少有应用，一是技术难度大，更重要的是少数几个CTC很难完整反映肿瘤完整的信息。目前FDA和CFDA有批准的CTC检测产品，均是根据肿瘤细胞特定抗原对CTC进行计数，利用血液中CTC数目提示疗效、预后等信息。

图一：血液中的CTC
 
（二）ctDNA

ctDNA（circulating tumor DNA，循环肿瘤DNA）是指人体血液循环系统中不断流动的携带一定特征（包括突变， 缺少，插入，重排，拷贝数异常，甲基化等）来自肿瘤基因组的DNA 片段。ctDNA 的主要来源包括：1、来自坏死的肿瘤细胞；2、来自凋亡的肿瘤细胞；3、循环肿瘤细胞；4、来自肿瘤细胞分泌的外排体。ctDNA有助于肿瘤患者的早期诊断，疗效监测、耐药评估及提前预测肿瘤的转移复发等。其中，由于胃癌高度异质性及治疗过程中胃癌基因突变的不确定性，ctDNA和CTC检测更能满足胃癌精准治疗的要求。

目前关于ctDNA的研究更多地集中于其携带的基因突变上，但利用基因突变不能回溯肿瘤原发灶，因此目前正在探索ctDNA甲基化作为肿瘤的生物标志物，DNA甲基化具有组织特异性，能帮助医生精确地追踪到原发肿瘤器官或组织。

 
 
图二：血液中的ctDNA
 
（三）外泌体

外泌体（Exosome），是一种能被大多数细胞分泌的微小膜泡，具有脂质双层膜结构，直径大约40-100 nm。最近几年，人们发现这种微小膜泡中含有细胞特异的蛋白、脂质和核酸，能作为信号分子传递给其他细胞从而改变其他细胞的功能。研究发现肿瘤细胞释放的外泌体的量较大，这些外泌体与肿瘤的发生、发展、转移以及抗药性具有一定的相关性。

因此，可以利用肿瘤细胞释放到血液中的外泌体，检测其中特异的蛋白和非编码RNA等，来分析肿瘤相关的信息。外泌体的分析主要对象是其中的特异性RNA和蛋白。例如，有研究发现胰腺癌病人血清中GPC1（glypican-1）阳性的外泌体占比显著增高；另有研究者发现，肿瘤会释放携带高水平miR-122的囊泡来营造适合肿瘤转移的土壤，这暗示着肿瘤外泌体中miR-122可能是一个潜在的标志物和药物靶点。

虽然外泌体应用的前景广阔，但目前仍处于研究阶段，其提取、纯化的技术难度较高，对于外泌体中具体标志物的选择，还需要科研上有更多成果的支持。

图三：CTC、ctDNA与外泌体比较
 
由于肿瘤DNA水平变异研究得最为成熟，而测序技术的发展也为ctDNA检测提供了技术手段。因此，目前ctDNA的应用最为成熟，尤其是在指导用药方面，ctDNA有无可比拟的优势。

ctDNA

ctDNA是血浆游离DNA（cell free DNA，cfDNA）的一部分。我们所说的ctDNA检测，实际上检测的是全部的cfDNA，再从中分析肿瘤特异的基因变异，也就是说利用肿瘤变异特征来代表其中的ctDNA。ctDNA在cfDNA中的比例波动范围较大，0.01％～90％，受肿瘤分期、转移等影响，大部分在千分之几的数量级，导致cfDNA中能检测到的肿瘤突变频率很低，因此，ctDNA的检测需要高灵敏度的技术以及解决捕获量低的新型富集方法。

（一）、ctDNA提取

ctDNA在外周血中含量很少, 片段很小, 容易与血浆蛋白结合, 常规的提取效率不高, 同时为排除凝血过程产生污染, 目前多采用血浆进行ctDNA 抽提。类似于PCR分子诊断的核酸前处理，常用于分离ctDNA 的方法也有两种，二者并没有本质区别，只是二氧化硅微粒的载体不同。
 
离心柱法：以硅胶滤膜作为固相载体的，基于二氧化硅选择性结合DNA 的独特属性。其原理是带负电的DNA骨架与带正电的硅胶滤膜之间的高亲和力。钠离子起到阳离子桥的作用，它可以吸引核酸磷酸骨架里带负电荷的氧。在高盐条件（pH≦7）下,钠离子可破坏水中的氢与硅中带负电荷的氧之间的氢键。通过大量漂洗去掉所有杂物后，用TE或Tris-Hcl 缓冲液或蒸馏水在低离子强度下（pH≧7）洗脱纯化的DNA。
 
磁珠法：带有磁荷的颗粒可通过磁场中的永磁将其移除。这些磁颗粒可用表面包被二氧化硅的氧化铁颗粒制成。因表面积大，结合核酸的能力较强，可作为较好的分离载体。如果赋予容器侧壁磁性，样品混合物中结合有核酸的磁珠则聚集到容器壁，直接倾倒容器可将其他杂质去除，避免了反复离心。磁珠表面包被有活性基团可特异性吸附核酸。

图四：ctDNA提取的两种方法比较

（二）、ctDNA检测
 
1.已知突变的ctDNA的检测（PCR）
 
由于肿瘤分离出的DNA 的质量和数量变化极大, 因此需要高特异性和高灵敏度的方法检测ctDNA。对于已知突变的ctDNA而言，检测手段有数字PCR (digital PCR, dPCR)、BEAMing (bead, emulsion, amplification and magnetic)、ARMS-PCR(amplification refractory mutation system, ARMS)。
 
2.未知突变的ctDNA的检测（NGS）
 
上述的几种技术准确率高，成本低，但是通量低，不能检测未知突变，未来发展能力有限。以肺腺癌为例，最大类的两个突变KRAS 和EGFR 分别占了16%和8%，有65%的突变是未知的。目前，检测未知序列的方法主要由两种：标记扩增深度测序(tagged-amplicon deepsequencing, TAm-Seq)技术和癌症个体化深度测序分析方法(cancer personalized profiling by deep sequencing, CAPP-Seq)。

图五：液体活检的检测技术的灵敏度比较
 
液体活检的巨大市场潜力

2020年3月份国家卫健委发布的《癌症防治核心信息及知识要点》显示，我国每年新发癌症病例超过350万，死亡病例超过200万，防控形势严峻。近年来，肺癌、乳腺癌及结直肠癌等发病呈显著上升趋势，肝癌、胃癌及食管癌等发病率仍居高不下。以肝癌为例，据西南证券研究报告，在不考虑市场渗透率的情况下，我国肝癌早筛早诊市场空间高达2000亿元。液体活检技术使得癌症早期阶段的筛查成为可能，无论是肿瘤诊断，治疗还是监控领域，液体活检的优势都使其成为最具发展潜力的肿瘤无创诊断手段，具有极高的临床应用价值和市场前景。

国家层面也对肿瘤早筛给予了高度重视，《“健康中国2030”规划纲要》就指出，要强化慢性病筛查和早期发现，针对高发地区重点癌症开展早诊早治工作，推动癌症脑卒中冠心病等慢性病的机会性筛查。并提出到2030年要实现全人群全生命周期的慢性病健康管理，总体癌症5年生存率提高15%。受到政策和市场的双重推崇，肿瘤早筛早诊已成为国内和国际研究的热门领域。

液体活检在资本市场的热度也越来越高，目前A股市场就有华大基因（300676SZ）、迪安诊断（300244SZ）、贝瑞基因（000710SZ）、美康生物（300439SZ）等十余家上市公司将肿瘤早筛以及液体活检纳入其业务范畴。美国ExactSciences公司的早期肝细胞癌（HCC）血液检产品在2019年获得FDA授予的突破性医疗器械认定；而Grail、广州燃石等在泛癌种液体活检早筛上也正在积极研发。在国内，已有多个研究机构在此领域开展研究，目前已有多家生物科技企业积极入局癌症早筛早诊领域，并进行产品转化。