干货｜挑战高反应活性基因毒性杂质—酰氯

本文转自诺衡分析
概述
酰卤化合物中以酰氯化合物最为常用，包括烷基酰氯和(取代)苯甲酰氯，结构如图1。酰氯化合物是药物合成中重要的酰化试剂，例如苯甲酰氯用于合成酮洛芬、氯乙酰氯用于制备奈非西坦、维拉佐酮由异丁酰氯合成、5-氯-2-噻吩甲酰氯是合成利伐沙班的重要中间体等。酰氯化合物具有警示结构基团，是潜在的基因毒性杂质，可能具有遗传毒性和致癌性。因此各国监管机构对药物中残留酰氯化合物的检测仍然十分重视，我们在之前的文章中也有所提到，因此需要建立一种专属性强、灵敏度高的方法对该类杂质进行控制。

图1.酰氯化合物结构图

由于酰氯化合物的化学性质非常活泼，具有很高的反应活性，直接利用HPLC法或GC法分析检测往往会产生很大的误差。采用GC法直接测定酰氯化合物时，酰氯化合物可能会出现与色谱柱的固定相发生反应，导致固定相的降解，从而造成基线波动大，重现性差；采用HPLC法直接测定时，酰氯化合物同样有可能出现与色谱柱上的硅羟基发生反应，或者与流动相中的水和甲醇发生反应，影响测定结果的准确性。由于直接检测法测定酰氯化合物存在着种种的缺陷和不足，故一般不采取该方法对酰氯化合物的残留进行测定，而通常采用化学衍生化的方法对酰氯化合物进行测定。

根据参考各国药典及文献，总结了部分含有酰氯类基因毒杂质药物的种类，详见表1。

表1. 含有酰氯类基因毒杂质药物列表
常用的检测方法
衍生化法：
一般来说，通常采用衍生化的方法用于酰氯类基因毒杂质的检测。根据衍生化试剂的不同，酰氯化合物的衍生化法主要分为水解法、酯化法和胺解法。

图2. 酰氯化合物衍生化反应(①水解反应；②酯化反应；③胺解反应)

水是检测酰氯常用的衍生化试剂之一，水解法的优势在于反应简单且迅速，酰氯和水反应生成的产物羧酸通常采用毛细管电泳色谱(CE)或液质联用(HPLC-MS)进行分析，但是酰氯的水解产物往往会与药物合成时用到的起始原料或者药物在储存过程中的降解产物结构相同，导致测定结果不准确。

酯化法和胺解法一般都能够准确测定药物中的酰氯残留。酯化法一般采用甲醇为衍生化试剂，据文献报道，采用甲醇为衍生化试剂，并结合GC-FID法能够准确测定5-CVC中间体中４种酰氯类杂质的残留量。但是以甲醇作为衍生化试剂的时候，必须要严格控制操作环境中的水分，否则会导致反应速率变慢，同时测定结果也可能会因药物中的含水量而受到影响，导致回收率较差。

胺解法则利用含胺基或肼基碱性基团的化合物做衍生化试剂，如：2-硝基苯肼、苯胺等。有文献报道，用苯胺作为衍生化试剂，吡啶为催化剂，采用LC-MS法测定了待测药物中的氯甲酸乙酯，LOD能够达到40ng/mL。
提供以下两个案例可供借鉴
左氧氟沙星：
左氧氟沙星(Levofloxacin，化合物1，图3)，是氧氟沙星的左旋光学异构体，由德国Hoechst公司和日本第一制药株式会社共同研发的，是一种氟喹诺酮类广谱抗菌药物。在左氧氟沙星的合成工艺(图3)中，一般以2, 3, 4, 5-四氟苯甲酰氯作为起始原料，通过反应得到中间体3后，与手性试剂(S)-2-氨基丙醇反应，引入手性，得到中间体4，之后在碳酸钾的条件下发生闭环反应得到中间体5，然后再酸性条件下水解后，再与N-甲基哌嗪经缩合反应制得左氧氟沙星成品，左氧氟沙星原料药中使用到的起始物料2, 3, 4, 5-四氟苯甲酰氯(TFC，化合物2，图3)结构与已知基因毒性杂质结构类似，具有警示结构，因此必须对其严格控制，控制其毒理学阈值(TTC)。根据ICH发布基因毒性杂质的最大摄取量为1.5 μg/d计算，对应的基因毒性杂质的TTC水平为2 ppm。

因此，采用衍生化后GC-MS的方法测定TFC，以甲醇为衍生化试剂，对衍生化产物2,3,4,5-四氟苯甲酸酯(TFB)进行测定。根据ICH指南要求，对方法进行了检测限(LOD)、定量限(LOQ)、线性、精密度、准确性等相关验证，两种杂质在0. 6ppm~2.4 ppm的范围内均成良好的线性关系，相关系数R2=0.997，两个杂质的LOD和LOQ分别能够达到0.2 ppm及0.6 ppm，回收率在84%~93.6%之间，该方法简单、准确，适合在痕量水平下对左氧氟沙星中酰氯类基毒杂质进行质量控制。

图3. 左氧氟沙星的合成工艺

利伐沙班:
利伐沙班(Rivaroxaban，化合物7，图4)是一种新型口服Xa因子直接抑制剂，由拜耳和强生公司联合开发，2008 年在欧盟和加拿大获得批准上市，2011年7月经美国FDA批准上市，该药物用于预防髋关节和膝关节置换术后患者深静脉血栓(DVT)和肺栓塞(PE)的形成。利伐沙班的合成是以4-(4-氨基苯基)-3-吗啉酮(化合物8，图4)与2-(环氧乙烷-2-基甲基)-1H-异吲哚-1,3(2H)-二酮(化合物9，图4)为原料，以异丙醇作为开环溶剂，经开环反应后再与双(三氯甲基)碳酸酯羰基化反应得到中间体，以甲胺去保护后直接与5-氯-2-噻吩甲酰氯经酰胺化后制备而得到利伐沙班成品。事实上，所用的原料5-氯-2-噻吩甲酰氯(CTCC，化合物7，图4)已经被证实具有潜在的遗传毒性和致癌性，因此，依据EMA和FDA相应的指导原则，有必要对利伐沙班中的5-氯-2-噻吩甲酰氯残留进行定量分析。

因此，以2-硝基苯肼为衍生化试剂，利用HPLC-UV的方法检测CTCC的衍生物，以0.1%磷酸水溶液-乙腈为流动相，在该方法下CTCC的LOD和LOQ分别为0.03 μg/mL和0.08 μg/mL，在0.08~0.8 μg/mL的浓度范围内均成良好的线性关系，相关系数R2>0.999。该方法快速、简单、准确且经过全面验证后符合检测的需求。

图4. 利伐沙班合成工艺
总结
酰氯类化合物作为潜在的基因毒性杂质，与肼类化合物一样，大多是从起始物料或者中间体中直接带入或者从合成副反应中引入，药品中如果含有上述物质以基因毒性杂质的形式存在时，药品的质量就会存在潜在的风险，对人类健康造成威胁。由于酰卤化合物性质极其活泼，因此需要结合杂质的不同特点，对分析方法进行系统研究和验证，建立一个合理的分析方法去检测和量化这些杂质的残留量，将杂质控制在安全合理的范围内。

基因毒性杂质控制是药品质量控制的核心内容之一，药品在临床使用中产生的不良反应往往与产品中的基因毒性杂质有关，使得药物安全性的风险控制面临严峻的挑战。因此基因毒性杂质研究及控制是药品安全保证的关键要素，也是确保药品研发中风险控制意识的重要体现。从药品的制备工艺和产品的结构分析入手，评估、预测产品中可能存在的副产物、中间体、降解产物以及试剂、催化剂是否具有遗传毒性，通过对药品生产工艺进行改进来优化来降低杂质含量，并选择合适的分析方法，准确分辨与定量杂质，确定杂质的合理限度。因此，药品研发与生产人员应该尽可能地从起始原料、中间过程、终产品以及流通、贮藏等各个环节进行控制，保证和提高药品的质量才是基因毒性杂质研究的最终目的。

本文根据以下文章进行编辑整理，仅用于学习、交流：
1.Raman N.V.V.S.S., Prasad A.V.S.S., Reddy KR. Sensitive derivatization methods for the determination of genotoxic impurities in drug substances using hyphenated techniques[J]. Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis, 2014 (89): 276– 281.
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3. Tang L, Kim A, Miller SA, et al. Development and validation of a specific and sensitive GC-FID method for the determination of impurities in 5-chlorovaleroyl chloride[J]. J Pharm Biomed Ana, 2010,53(3): 309-314.