食品中的miRNA能够同时控制动物病毒性疾病和人类肿瘤发生

本文转自生信人
本文从动物病毒和人肿瘤发生的代谢紊乱机制相似的理论角度，希望识别动物抗病毒的miRNAs，并论证其对人类肿瘤的抑制作用。这篇工作主要是实验，在虾中识别到了一种抗白斑综合症病毒感染的miRNA（miR-34），并发现即使蒸煮的高温也不会影响其表达，并且熟虾中的miR-34对乳腺癌进展的抑制作用，且在小鼠实验中得到论证。所以本文的重点是，多吃熟虾！！！
一、摘要在动物感染病毒期间，病毒在宿主细胞中完成其生命周期。病毒感染会导致宿主代谢失调，进而导致代谢紊乱，最终发展为癌症。由于在动物中发生的病毒感染导致的代谢紊乱与人类肿瘤发生的代谢紊乱相似，并且动物抗病毒的miRNAs在本质上维持动物细胞代谢稳态，在人体内可能具有抗肿瘤活性。然而，目前为止还没有关于这个问题的相关研究。
该研究识别了一种潜在的虾抗白斑综合症病毒（WSSV）感染病毒miRNA，虾miR-34。研究发现在虾喂养的表达miR-34的细菌中，过表达miR-34可以通过靶向病毒wsv330和wsv359基因来抑制WSSV感染。此外，在给小鼠喂食miR-34过表达的虾后，miR-34表达通过靶向人的CCND1、CDK6、CCNE2、E2F3、FOSL1和MET基因来抑制乳腺癌进展。研究表明，食品中的miRNAs可能成为同步控制动物病毒性疾病和人类癌症的有效策略。
二、结果1. 食品中虾miR-34对虾病毒性疾病的控制这一部分主要是通过投喂表达miR-34的重组菌以及WSSV，并从WSSV拷贝数变异和虾死亡率变化的角度来分析miR-34对虾病毒性疾病的控制情况。首先在细菌中表达miR-34，然后对虾饲喂表达miR-34的重组菌，Northern印迹杂交分析显示成熟虾miR-34在IPTG诱导的重组菌中表达情况（图1A）。为了方便制备食品，将表达成熟miR-34的细菌在60℃热灭活。热灭活后，IPTG诱导的重组菌中检测到足够数量的成熟miR-34（图1B）。然后将热灭活的表达虾miR-34的细菌（bacteria-miR-34）与饲料混合，给虾投喂混合饲料，再投喂WSSV。结果显示，与对照组相比，含bacteria-miR-34饲料喂养的虾中成熟miR-34表达显著增加（图1C）。miR-34在虾体内持续高表达，导致WSSV拷贝数和病毒感染虾死亡率显著下降（图1D-E）。然而，含有bacteria-miR-34-scrambled（即无功能的对照组）饲料喂养的虾的WSSV拷贝数和死亡率与单独WSSV控制组是一致的（图1D和1E）。结果表明，在喂养miR-34表达的细菌后，成熟的miR-34在虾体内的表达水平升高，促进了虾的抗病毒免疫反应。

图1. 食品中miR-34对虾病毒性疾病的控制

2. 虾中miR-34抵御WSSV感染的作用机制这一部分首先是识别了miR-34对WSSV的靶基因，然后通过实验对miR-34与靶基因之间的相互作用进行分析，最后分析了靶基因沉默对病毒感染的虾死亡率的影响。基于WSSV基因的3’UTRs，使用TargetScan搜索每个miRNA种子序列，并根据miRanda匹配整个miRNA序列，两种算法获得的基因为虾miR-34的潜在靶基因。结果表明，两个WSSV基因（wsv330和wsv359）是虾miR-34的靶基因（图2A）。接下来研究了虾miR-34与WSSV基因之间的相互作用，克隆了wsv330和wsv359基因的3’UTRs及其相应的突变体，将其与EGFP基因（绿色荧光蛋白）融合构建（图2B）。共转染合成的miR-34共构建物导致荧光强度显著下降（图2C-D），而miR-34-scrambled不影响EGFP的表达。表明虾miR-34直接靶向wsv330和wsv359基因。接下来发现miR-34过表达会导致wsv330和wsv359表达显著下降（图2E-F）。使用siRNA抑制wsv330或wsv359基因的表达，评估其在WSSV感染中的作用（图2G-H），发现沉默wsv330或wsv359会导致虾中WSSV拷贝数和病毒感染死亡率显著下降（图2I-J）。综上，虾miR-34直接靶向病毒wsv330和wsv359基因，抑制病毒在虾体内的感染，从而使其代谢正常，高存活率，生长良好（图2K）。

图2. 虾中miR-34抵御WSSV感染的作用机制
3. 熟虾中miR-34对乳腺癌进展的抑制作用这部分的内容主要是先评估了虾的高温蒸煮是否会对成熟miR-34的表达造成破坏，然后探究了在含有bacteria-miR-34的饲料喂养后的虾对乳腺肿瘤的抑制作用，并研究了miR-34对乳腺癌细胞周期阻滞以及迁移、粘附和侵袭的作用。然后进一步的分析了miR-34对细胞周期相关的几个关键基因和生长因子是否有靶向抑制作用。
为了评估饲料中bacteria-miR-34对癌细胞发展的影响，首先对虾进行了蒸煮，并分析了虾miR-34对乳腺癌细胞生长和转移的影响。与对照组相比，用bacteria-miR-34喂养的熟虾中miR-34水平更高（图3A），表明虾烹饪不破坏成熟miR-34。
每天给虾喂食bacteria-miR-34后，miR-34在虾体内持续表达。接下来分析了虾miR-34在肿瘤发生的影响，从喂食了bacteria-miR-34或bacteria-miR-34-scrambled以及对照组（只喂食虾饲料）的虾肌肉中提取miRNAs，并转染到两种乳腺癌细胞中。结果显示虾miR-34在转染的细胞中表达（图3B），且能够显著抑制乳腺癌细胞的生长和转移与控制（图3 C-D）。说明从煮熟的虾中提取的miR-34对乳腺癌进展的抑制作用。流式细胞仪分析显示，对乳腺癌细胞用饲喂了bacteria-miR-34的虾的肌肉中miRNA处理，细胞会停滞在G0 / G1期（图3E），说明miR-34-expressing菌饲喂的熟虾中获取的miR-34会影响细胞周期阻滞，抑制了乳腺癌细胞的迁移、粘附和侵袭（图3F-H）。这些数据表明，饲喂了miR-34-expressing菌的煮熟虾中的miR-34对乳腺癌细胞的生长和转移有抑制作用。为了评估饲喂了miR-34-expressing菌的煮熟虾中的miR-34是否靶向CCND1、CDK6、CCNE2、 E2F3、MET和FOSL1基因，接下来研究了这6个基因在转染了饲喂了miR-34-expressing菌的煮熟虾肌肉中miRNAs的乳腺癌细胞中的表达情况。实时荧光定量PCR分析显示这6个基因表达下调（图3I），表明miR-34介导了靶基因表达的调控，Western blot分析也是相似结果（图3J）。结果表明，从饲喂了miR-34-expressing菌的熟虾中获得的虾miR-34通过靶向人类CCND1、CDK6、CCNE2、E2F3、MET和FOSL1基因抑制乳腺癌进展。

图3. 熟虾中miR-34对乳腺癌进展的抑制作用
4. 饲喂了miR-34-expressing菌的熟虾中miR-34抑制体内乳腺肿瘤生长和转移这一部分的主要工作是对小鼠进行体内实验来验证miR-34对肿瘤的抑制作用。首先对评估乳腺癌小鼠喂食了miR-34后肿瘤的生长抑制情况，然后通过荧光素酶实验评估了乳腺癌小鼠喂食了miR-34后肿瘤的转移抑制情况。
接下来将乳腺癌细胞注入到雌性老鼠中，然后对小鼠喂食来源于饲喂了miR-34-expressing菌的熟虾的肌肉，然后测量肿瘤的生长和转移（图4A）。结果表明，喂食miR-34饲料的小鼠与喂食正常饲料的小鼠相比，实体瘤的生长和大小显著降低（图4B-C）。喂食了虾miR-34小鼠的血液和实体瘤中miR-34表达水平远远高于喂养了常规饲料的小鼠（图4D-E）。这些结果表明，外源性虾miR-34可以通过食物传递到小鼠，抑制体内乳腺肿瘤生长。喂食了虾miR-34小鼠的miR-34靶基因（CCND1、CDK6、CCNE2、E2F3和MET）的表达水平显著下调（图4F-H）。结果表明，在体内，虾miR-34通过下调靶基因的表达来抑制乳腺癌的生长。
然后将表达荧光素酶的乳腺癌细胞注射到裸鼠，给小鼠喂食miR-34表达的熟虾的肌肉，发光流动数据显示，miR-34饲料处理的小鼠乳腺癌细胞向肺部的转移显著受到抑制（图4I）。而与用不含miR-34虾饲料处理的小鼠每个肺上产生更多的转移性肿瘤结节（Fig 4J），表明miR-34显著降低了肿瘤在肺中的定殖。喂食miR-34饲料后，小鼠的miR-34表达水平升高（图4K）。以上研究结果表明，通过食物摄入miR-34能够通过靶向多个基因抑制小鼠的肿瘤发生（图4L），miR-34作为一种癌症治疗分子，能够抑制乳腺癌的进展。

图4. 表达miR-34的细菌饲养的熟虾中miR-34抑制乳腺肿瘤的生长和转移
总结：本工作主要对虾中识别到的一种抗白斑综合症病毒感染的miRNA，miR-34进行抗肿瘤作用分析。首先分析了miR-34对虾病毒性疾病的控制情况，发现其表达能够导致WSSV拷贝数和病毒感染虾死亡率显著下降。然后识别了miR-34对WSSV的靶基因，通过实验对miR-34与靶基因之间的相互作用进行分析，发现虾miR-34直接靶向病毒wsv330和wsv359基因，抑制病毒在虾体内的感染，从而使其代谢正常，高存活率。接下来评估了虾的高温蒸煮是否会对成熟miR-34的表达造成破坏，分析了在含有bacteria-miR-34的饲料喂养后的虾对乳腺肿瘤的抑制作用，发现miR-34对乳腺癌细胞周期阻滞以及迁移、粘附和侵袭的作用。最后对小鼠进行体内实验来验证miR-34对肿瘤的抑制生长和转移的作用。