中科院天工所：成功创建高效的枯草芽孢杆菌蛋白表达系统

期刊：Bioresources and Bioprocessing
论文：A facile and robust T7-promoter-based high-expression of heterologous proteins in Bacillus subtilis
研究背景
枯草芽孢杆菌普遍被认为是一种生物安全菌株，是重要的工业蛋白生产宿主，特别是α-淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶和β-葡聚糖酶等蛋白。但是，枯草芽孢杆菌用于生产异源重组蛋白仍存在表达水平低、转化困难、遗传操作复杂等缺点。大肠杆菌T7表达系统是异源重组蛋白生产应用最广泛的表达系统之一，具有遗传操作简单、基因调控严谨、蛋白表达效率高等特点。但是，大肠杆菌本身带有内毒素，难以应用于食品和添加剂等领域。随着合成生物学技术的发展，枯草芽孢杆菌现有表达系统越来越无法满足研究和生产的需求。因此，将枯草芽孢杆菌作为原核表达宿主的优势和T7表达系统蛋白表达效率高的特点相结合，开发出一套具有普遍适用性的枯草芽孢杆菌T7表达系统，为重组蛋白的高效表达提供了一种新工具。
研究内容
为了使枯草芽孢杆菌T7表达系统具备遗传操作简单、蛋白表达高效、适宜高密度发酵等优势，本研究进行了如下设计：1)超级高效感受态制备。鉴于枯草芽孢杆菌的转化效率低，并且制备步骤繁琐，在基因组上引入启动子PxylA调控的感受态调节因子comK基因，通过木糖诱导能够快速简单的制备超级高效感受态细胞；2)防止异源蛋白降解。枯草芽孢杆菌的两个主要蛋白酶编码基因aprE和nprE被失活；3)高密度发酵。为了避免高密度发酵过程中形成孢子和产生大量泡沫，编码RNA聚合酶sigma-F因子的spoIIAC基因和编码surfactin合酶亚基3的srfAC基因被失活；4)引入T7表达系统。枯草芽孢杆菌基因组上amyE位点插入组成型启动子P43调控的T7 RNA聚合酶编码基因，而重组蛋白编码目的基因通过游离质粒pHT7表达。质粒pHT7由pHT01衍生而来，引入了T7-lac 杂合启动子、RBS序列(AAGGAGG)、目的基因(如绿色荧光蛋白gfp)和 T7 终止子。目的基因的表达通过添加诱导剂IPTG启动。

测试枯草芽孢杆菌T7表达系统在异源重组蛋白的表达效果，如绿色荧光蛋白、α-葡聚糖磷酸化酶、肌醇单磷酸酶、磷酸葡萄糖变位酶和 4-α-葡聚糖转移酶，胞内蛋白的表达水平在25−40%之间。在5 L发酵罐中进行补料分批发酵，肌醇单磷酸酶产量高达4.78 g/L。
该表达系统具有适用性广(对难折叠蛋白，比大肠杆菌更好)，蛋白表达水平高，遗传操作简便(PCR方法准备质粒，不用酶切酶连, 与DNA序列无关)，感受态细胞准备容易，可以长期保存，以及转化效率高、遗传稳定性好、适合高细胞密度发酵等优点。
引用方式：Ye, J., Li, Y., Bai, Y. et al. A facile and robust T7-promoter-based high-expression of heterologous proteins in Bacillus subtilis. Bioresour. Bioprocess. 9, 56 (2022).
作者简介
论文第一作者叶静和李运杰分别是天津商业大学研究生和中科院天津工业生物技术研究所助理研究员。通讯作者为中科院天津工业生物技术研究所张以恒研究员、天津商业大学吴子健教授和中科院天津工业生物技术研究所石婷副研究员。
张以恒研究员，现任中科院天津工业生物技术研究所体外合成生物学中心主任，原美国弗吉尼亚理工大学终身正教授，开创体外多酶分子机器（体外生物制造）领域，并且率先应用该技术平台实现工业化生产。代表性工作有：从纤维素制淀粉、糖裂解水生产氢能、高能糖燃料电池、多酶肌醇合成、健康糖新制造等。Google学者引用超过17000次，H指数70；已在PNAS, Energy Environ. Sci., Angew. Chem., Nat. Commun., Biotech. Bioeng., ACS Catal.等70多种杂志发表论文超过150余篇，获得国外专利50项以上。