江南大学陈坚院士团队赵鑫锐AS：构建精细调控血红素合成的大肠杆菌用于制备高效全细胞P450酶催化剂

本文转自 AdvancedScienceNews
创新点：针对大肠杆菌P450酶全细胞催化剂构建面临的血红素供给不足问题，采用适度强化血红素合成的理性改造策略，并将血红素生物感应器和sRNA技术相结合构建出了可平衡血红素合成和P450酶表达的精细调控系统。在此基础上，所构建的高活性P450酶全细胞催化剂可用于高效合成天然产物、药物等高附加值产品。
关键词：P450酶，血红素合成，血红素感应器，sRNA，全细胞催化

细胞色素P450酶(P450s, CYP)是一类以血红素为辅基的酶，可以以萜类、脂肪酸、生物碱和类固醇等多种化合物为底物合成高附加值的天然产物和药物。为更高效的利用多功能P450酶, 以往的研究中多采用胞外酶促催化的方法。但该方法往往需要对P450酶进行纯化，而且需要额外的添加昂贵的辅因子NAD(P)H和辅因子循环系统，催化合成成本较高。因此，在本研究中以大肠杆菌作为宿主，利用胞内已有的辅因子和优化的P450酶表达策略，采用全细胞催化的形式实现底物的转化。但在催化过程中发现， 由于大肠杆菌中P450酶的高效表达，所需血红素辅基的供给存在不足，因此严重限制了P450酶全细胞的催化效率。
在之前的研究中，针对微生物宿主细胞内血红素供给不足的问题主要有两种解决策略：(1)外源添加血红素或其前体5-氨基乙酰丙酸。但由于添加5-氨基乙酰丙酸成本较高(合成成本提高60%以上)，且商业化大肠杆菌普遍缺少血红素转运系统，通常需要表达血红素转运蛋白才能利用外源添加的血红素，而表达血红素转运蛋白对P450酶全细胞催化活性的影响还未见报道；(2)强化宿主细胞内的血红素合成途径。但目前的研究都是以血红素作为终产物来改造其合成途径，并不适用于P450酶全细胞催化体系；强化的策略均是较为简单的过量表达合成途径中的单个酶，而忽视了血红素合成途径关键酶的协同作用。因此，针对P450酶全细胞催化所面临的血红素供给不足问题，目前还没有直接可用的代谢改造策略。
此外，由于血红素也具有较强的毒性作用，过量的血红素将会严重抑制细胞的生长；且过量合成的血红素合成酶也会降低P450酶的正常表达水平。因此，对细胞内血红素合成的改造只能是适度强化，需要严格控制好血红素合成与P450酶表达之间的代谢平衡。在之前的研究中，已采用了CRISPRi技术可以调控细胞内血红素的合成速率，但由于Cas9蛋白降解速率较慢，导致血红素合成开关调控周期较长(6小时以上)，并不适用于快速制备高活性的全细胞P450酶催化剂。而sRNA调控策略具有调控精准、调控周期短等优势，但应用该策略能否实现大肠杆菌中血红素合成与P450酶表达之间的代谢平衡还需要验证。
针对这些问题，江南大学食品合成生物学与生物制造团队研究人员构建了可以精准调控血红素合成的大肠杆菌底盘细胞 (图1)。首先，通过比较选择了大肠杆菌C41(DE3)和高拷贝数质粒(pRSFDuet-1)作为P450酶最佳表达体系 (图2)。随后，通过比较选择过量表达来源E. coli Nissle 1917的血红素受体蛋白(ChuA)构建血红素转运系统，并确定了含有强诱导启动子(T7lac)的中低拷贝数质粒(pCDFDuet-1)表达chuA，可转运2.5 nM血红素至胞内，但血红素转运强化后的单组分P450 BM3以7-乙氧基香豆素为底物全细胞活性仅提高了16.1%，三组分P450 sca-2以美伐他汀为底物全细胞活性仅提高了29.4% (图3)。
因此，研究人员选择了通过改造血红素生物合成途径来进一步增强胞内血红素供应。通过比较多种血红素途径强化策略，最终选择了整合表达血红素生物合成途径种关键酶(HemA、HemL、 HemB、 HemC、 HemD 和HemH)并使用DNA支架组装HemB、 HemC和HemD，胞内血红素含量可提高至0.2-0.4 mg/L，P450 BM3以7-乙氧基香豆素为底物全细胞活性提高了3倍 (87.6 U g-1 DCW) (图4)。在血红素合成强化菌株基础上，比较和选择了来源Lactococcus lactis的血红素转录调控蛋白，经突变改造后与sRNA调控策略相结合，构建出适合大肠杆菌血红素合成调控的生物感应器。应用该生物感应器，P450 BM3全细胞活性进一步提高至125.9 U g-1 DCW (图5)。
最后，运用血红素供给精准调控大肠杆菌制备的全细胞P450酶催化剂，单组分P450 BM3催化苯酚合成化学中间体对苯二酚的效率提高了1.4倍；三组分P450 sca-2催化美伐他汀合成药物普伐他汀的效率提高7.9倍；三组分CYP105D7催化黄豆苷原合成天然产物7,3',4'-三羟基异黄酮的效率提高8.1倍 (图6)。此研究为在大肠杆菌中高效合成血红素类蛋白如P450酶、肌红蛋白、血红蛋白、过氧化物酶等提供了可借鉴的策略。
上述研究工作得到了国家重点研发计划项目（2019YFA0906400）、国家自然科学基金（31900067）和国家轻工业技术与工程一流学科（LITE2018-08）等项目的资助。

WILEY

论文信息：
Whole-Cell P450 Biocatalysis Using Engineered Escherichia coli with Fine-Tuned Heme Biosynthesis
Baodong Hu, Haibo Yu, Jingwen Zhou, Jianghua Li, Jian Chen, Guocheng Du, Sang Yup Lee, Xinrui Zhao*
Advanced Science
DOI: 10.1002/advs.202205580