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MTT实验总结

2011-03-25 来源:亚科官网

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物,是一种接受氢离子的染料,可作用于活细胞线粒体中的呼吸链,在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂,生成蓝色的formazan结晶,formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比(死细胞中琥珀酸脱氢酶消失,不能将MTT还原)。还原生成的formazan结晶可在含50%N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠(pH 4.7)的MTT溶解液中溶解,利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值,以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光,用铝箔纸包好就可以。

MTT步骤:

1、接种细胞:用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液,以每孔100010000细胞接种到96孔板,每孔体积200ul.

2、培养细胞:同一般培养条件,培养35天(可根据试验目的和要求决定培养时间)。

3、呈色:培养35天后,每孔加MTT溶液(5mg/mlPBS )20ul。继续孵育4小时,终止培养,小心吸弃孔内培养上清液,对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO,振荡10分钟,使结晶物充分融解。

4、比色:选择490nm波长,在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值,记录结果,以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

MTT注意事项:

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰:一般选小于10%的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照:与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致,最后比色以空白调零。

4MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间,超出这个范围就不是直线关系,

IC50是半抑制率,意思是抑制率50%的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度,然后计算各自的抑制率,以药品的浓度为横坐标,抑制率为纵坐标作图,然后得到50%抑制率时候的药品浓度,就是IC50。要点:药品2倍稀释,多做梯度,做点线图即可!

举个例子:各组浓度0.10.010.0010.00010.000010.000001,稀释倍数为10,最大浓度为0.1,抑制率为0.95 0.800.650.430.210.06。代入 计算公式:lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。其中:Xm:lg 最大剂量;I:lg(最大剂量/相临剂量)P:阳性反应率之和;Pm:最大阳性反应率;Pn:最小阳性反应率;抑制率=1-加药组OD/对照组OD值。公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率

Pm=0.95Pn=0.06P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1Xm=lg0.1=-1lgI=lg0.1/0.01=1lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025IC50=0.00025

例如用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT细胞活力,应该加多少1640培养基,多少MTTDMSO合适?根据书上说的加200ul164020ulMTT150ulDMSO ,加DMSO之前要尽量去掉培养液,便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。

一般每孔4000细胞为宜,既细胞浓度在20000/mlMTT20ul,作用四小时后洗掉上清液,注意不要将甲瓉洗掉,然后每孔加150μl DMSO,在脱色摇床上振荡10分钟,然后测吸光值。

一般要低于IC50,避免非调亡性杀伤的细胞太多,造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3IC50,作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%,用药后一般为5-10%Annexin V),细胞周期的亚G0峰比较明显。



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