MTT实验总结

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。

MTT步骤：

1、接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.

2、培养细胞：同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。

3、呈色：培养3－5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS 配)20ul。继续孵育4小时，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10分钟，使结晶物充分融解。

4、比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。

MTT注意事项：

1、选择适当得细胞接种浓度。

2、避免血清干扰：一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。

3、设空白对照：与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，最后比色以空白调零。

4、MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系，

IC50是半抑制率，意思是抑制率50％的时候药物的浓度。把药品稀释成不同的浓度，然后计算各自的抑制率，以药品的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，然后得到50％抑制率时候的药品浓度，就是IC50。要点：药品2倍稀释，多做梯度，做点线图即可！

举个例子：各组浓度0.1、0.01、0.001、0.0001、0.00001、0.000001，稀释倍数为10，最大浓度为0.1，抑制率为0.95、 0.80、0.65、0.43、0.21，0.06。代入 计算公式：lgIC50=Xm-I(P-(3-Pm-Pn)/4)。其中：Xm:lg 最大剂量；I:lg(最大剂量/相临剂量)；P:阳性反应率之和；Pm:最大阳性反应率；Pn:最小阳性反应率；抑制率=1-加药组OD值/对照组OD值。公式中的最大最小阳性反应率就是最大最小抑制率 。

Pm=0.95；Pn=0.06；P=0.95+0.80+0.65+0.43+0.21+0.06=3.1；Xm=lg0.1=-1；lgI=lg0.1/0.01=1；lgIC50=-1-1*(3.1-(3-0.95-0.06)/4)=-3.6025；IC50=0.00025

例如用96孔板培养SMMC-7721肝癌做MTT测细胞活力，应该加多少1640培养基，多少MTT和DMSO合适？根据书上说的加200ul1640、20ulMTT、150ulDMSO ，加DMSO之前要尽量去掉培养液，便于DMSO溶解甲臜颗粒进行比色测定。

一般每孔4000个细胞为宜，既细胞浓度在20000个/ml，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150μl DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。

一般要低于IC50，避免非调亡性杀伤的细胞太多，造成流式细胞仪检测碎片太多。我一般用1/2-1/3的IC50，作用时间为36h。一般肿瘤细胞系空白处理的调亡率应低于1%，用药后一般为5-10%（Annexin V），细胞周期的亚G0峰比较明显。