薄层板的制备、活度测定及应用

1．实验原理

1.1 薄层层析是一种微量、快速的层析方法。它不仅可以用于纯物质的鉴定，也可用于混合物的分离、提纯及含量的测定。还可以通过薄层层析来摸索和确定柱层析时的洗脱条件。　　根据分离的原理不同，薄层层析可以分为两类：用吸附剂铺成的薄层所进行的层析为吸附薄层层析；用纤维素粉、硅胶、硅藻土为支持剂铺成的薄层，属于分配薄层层析。薄层层析中以吸附薄层为多用，吸附薄层中常用的吸附剂为氧化铝和硅胶。

1.2 吸附薄层主要是利用吸附剂对样品中各成分吸附能力不同，及展开剂对它们的解吸附能力的不同，使各成分达到分离。吸附作用主要由于物体表面作用力、氢键、络合、静电引力、范德华力等产生。吸附强度决定于吸附剂的吸附能力，还受被吸附成分的性质影响，更与展开剂的性质有关。

1.3 分配薄层层析的原理是，用极性溶剂吸苷在固体支持剂上所形成的混合物，铺成薄层（或装柱），然后活化、点样（或上样），再用极性较弱的展开剂（或洗脱剂）进行展开。在展开过程中，各成分在固定相和流动相之间作连续不断的分配。由于各成分在两相间的分配系数不同，因而可以达到相互分离的目的。

     化合物的吸附能力与它们的极性成正比，具有较大极性的化合物吸附较强，因此Rf值较小。在给定的条件下（吸附剂、展开剂、板层厚度等），化合物移动的距离和展开剂移动的距离之比是一定的，即Rf值是化合物的物理常数，其大小只与化合物本身的结构有关，因此可以根据Rf值鉴别化合物。

1.4 薄层层析可适用小量样品（几到几十微克甚至0.01μg）的分离：也可用于多达５００mg样品的分离，是近代有机化学中用于定性，定量的一种重要手段。特别适用于那些挥发性小的化合物，以及在高温下易发生化学变化而不能用气相色谱分析的物质。

2．实验步骤

2.1 薄层板的制备

2.1.1 氧化铝羧甲基纤维钠薄层

取氧化铝粉末一份，置烧杯中加适量的羧甲基纤维素钠溶液搅拌，直至混合成搅拌时，物质能够在玻璃棒上掉下时成一条状，放置片刻，待杯里没有气泡后用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布），均匀涂布成0.25~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中110℃活化0.5~1小时，冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。

2.1.2硅胶G薄层 

 取硅胶G或硅胶GF一份，置烧杯中加水约5份混合均匀，放置片刻，待杯里没有气泡后用药匙取一定量，分别倒在一定大小的玻璃片上（或倒入涂布器中，推动涂布），均匀涂布成0.25~0.5mm厚度，轻轻振动玻璃板，使薄层面平整均匀，在水平位置放置，待薄层发白近干，于烘箱中110℃活化0.5~1小时，冷后贮于干燥器内备用。活化温度和时间可依需要调整，一般检识水溶性成分或一些极性大的成分时，所用薄层板只在空气中自然干燥，不经活化即可贮存备用。

2.1.3硅胶（H）羧甲基纤维钠（CMC-Na）薄层  

取羧甲基纤维素0.2g，溶于25ml水中，在水浴上加热搅拌使完全溶解，静置一夜，取上层清液，加薄层层析用硅胶（颗粒度10~40μm的约6~8g）。激光照排系统混成均匀的稀糊，按照硅胶G薄层涂布法制备薄层，或取0.8%羧甲基纤维纳10ml，倒入广口瓶（高约10~12cm）中，然后逐步加入薄层层析用硅胶3.3克，不断振摇成均匀的稀糊，把两块载玻片面对面结合在一起，这样每片只有一面与硅胶糊接触，使薄片浸入硅胶稀糊中，然后慢慢取出，分开二块薄片，将未粘附硅胶糊的那一面水平放在一张清洁的纸上，让其自然阴干，100℃下烘30分钟。冷后于干燥器内备用。未消耗的硅胶稀糊可贮存在广口瓶内，以供再用。

2.2 吸附剂的活度测定

2.2.1氧化铝活度的测定：一般可用4~5种偶氮染料以薄层层析法进行测定。

常法制备含粘合剂氧化铝薄层，以铅笔尖或毛细管尖在薄层板一端2~3 cm处间隔1cm左右轻轻点上5个可以看清的小点，分别用毛细管吸取0.02ml染料试剂苏丹红、二甲基黄、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅱ四氯化碳溶液、偶氮苯溶，分别点滴于原点上，以四氯化碳为展开剂，展开时薄层板与容器底部交角为10~40°之间，展开后测出各斑点的Rf值，从表1确定氧化铝的活度（一般高活性氧化铝Ⅰ~Ⅲ级活度使用本法时，结果往往偏低）。

表1  氧化铝活度与偶氮染料外值关系

2.2.2 硅胶活度的测定：一般选用三种染料的薄层层析法进行测定。

分别用毛细管吸取苏丹红、二甲基黄、苏丹红Ⅳ、苏丹红Ⅱ四氯化碳溶液、偶氮苯溶液各10μl点滴于硅胶G或硅胶H薄层上，以苯为展开剂，展开10cm（约20分钟）。二甲基黄斑点在薄层的当中。苏丹红斑点与二甲基黄斑点之间，则认为薄层板活性符合要求。

2.3 薄层层析的应用

分别用毛细管吸取湖北贝母总生物碱氯仿溶液点滴在硅胶CMC- Na薄层，以C₆H₅-EtoAc-NHEt₂（6：4：1）为展开剂进行展开，待展开剂上到离薄层板顶端约1cm时，取出，晾干薄层板，然后再薄层板上喷洒显色剂改良碘化铋钾喷雾，晾干，观察薄层板分离效果。重复上述操作，吸附剂改为硅胶G-CMc-Na板，样品改为丹参乙醚提取液，展开剂改为石油醚-醋酸乙酯（4：1）。

3．实验结果

3.1 实验制备的含粘合剂氧化铝薄层板容易掉粉末，粘合效果欠佳，并且稍微刮碰，即出现刮伤状的凹凸不平，氧化铝薄层板质量欠佳。

3.2 实验制备的硅胶G薄层，表面平整均匀，无明显的气泡，并且硅胶的粘合效果良好，不易掉粉，硅胶G薄层板的质量良好。

3.3 实验制备的硅胶H薄层，表面平整均匀，无明显气泡出现，但是稍微一抹，薄层板掉粉现象严重，粘合效果欠佳，说明薄层板的质量欠佳。

3.4 对薄层板进行活度测试

3.4.1对氧化铝薄层板活度测试，观察薄层板，发现拖尾现象较严重，每个样品的大点后面都有很长的一条线，造成此原因可能为点样太浓了和点样之后没吹干溶剂。把表2与表1数据对比，对偶氮苯展开氧化铝的活度为三级，对苏丹红展开氧化铝的活度为四级，而其他三个样品二甲基黄、苏丹红Ⅱ、苏丹红Ⅳ的Rf值也较高，氧化铝活度级数都较高，说明实验制备的氧化铝薄层板的含水量高，活性较低，其吸附能力较低。而一般常用的是二级与三级吸附剂，一级的吸附性太强，而且容易吸水，五级的吸附性太弱。

表2 氧化铝薄层板活度测试展开剂为四氯化碳

3.4.2 对硅胶G薄层板活度测试，观察薄层板情况，可以看到有拖尾现象，而且二甲基黄，偶氮苯的点扩散成一个很大的点，造成此原因可能是点样的量过多同时没有吹干溶剂，使得展开的时候样品扩散。从表3可以看到，各个样品的Rf值都较大，说明吸附剂的吸附效果不太好。

表3  硅胶G薄层板活度测试  展开剂为苯

3.4.3 对硅胶H薄层板活度测试，观察薄层板，可以看到有严重的拖尾现象，而且溶剂泡过的地方吸附剂有明显的脱落现象，与硅胶G薄层板相比，可能少了石膏粘合剂而且羧甲纤维素钠添加的量少，同时粘合效果不佳，造成硅胶H薄层板脱落严重。

表4 硅胶H薄层板活度测试  展开剂为苯

3.4.4 对硅胶GF高效板活度测试，观察薄层板，样品在薄层板上明显呈一点状，后面无拖尾现象，与自行铺设的薄层板相比，样品点清晰，容易判断，展开效果好。从表5可以看到，个样品的Rf都落在了0.2~0.8的区间上，展开效果好。

表5 硅胶GF254高效板活度测试  展开剂为苯

3.5 取硅胶Gf高效板对湖北贝母生物碱成分进行检识，在展开剂C₆H₅-EtoAc-NHEt₂（6：4：1）展开之后，吹干，观察薄层板无点，无现象，放在紫外灯下明显看到样品点留在原点，无展开现象，而喷洒显色剂之后，原点上的两个样品变成黑色。换成展开剂为C₆H₅-EtoAc-NHEt₂（3：4：1），其极性提高，样品点有稍微的上升。说明样品中的生物碱的极性较高，需要换成极性高的展开剂才能得到好的分离效果。

3.6取硅胶Gf高效板对丹参色素进行检识，在展开剂石油醚-醋酸乙酯（9：1）展开之后，吹干，观察到薄层板上距离原点线约0.5cm处有明显的点，而且点后面出现成一条线状的拖尾现象，展开剂的极性过低，对样品的展开效果欠佳，样品点上升的高度过低。