杂交探针种类及其选择

       探针的概念
　　放射性同位素、生物素或荧光染料进行标记的已知序列的核酸片段，即为探针（probe）。探针可用于分子杂交，杂交后通过放射自显影、荧光检测或显色技术，使杂交区带显现出来。

　　探针的种类极其选择

　　基因探针根据标记物不同可粗分为放射性探针和非放射性探针两大类；根据探针的来源及核酸性质不同又可分为DNA探针，RNA探针，cDNA探针，及寡核苷酸探针等几类。

　　1、DNA探针
　　DNA探针是最常用的核酸探针，指长度在几百碱基对以上的双链DNA或单链DNA探针。现已获得DNA探针数量很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动物和人类细胞DNA探针。这类探针多为某一基因的全部或部分序列，或某一非编码序列。

　　DNA探针的获得有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细菌为例，目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比之G + C百分比值要准确的多，是细菌分类学的一个发展方向。加之分子杂交技术的高敏感性，分子杂交在临床微生物诊断上具有广阔的前景。 

　　DNA探针（包括cDNA探针）的优点：
　　①这类探针多克隆在质粒载体中，可以无限繁殖，取之不尽，制备方法简便。
　　②不易降解（相对RNA而言），一般能有效抑制DNA酶活性。
　　③DNA探针的标记方法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移，随机引物法等，能用于同位素和非同位素标记。

　　２、cDNA 探针
　　cDNA （complementary DNA）探针是指互补于mRNA的DNA分子，是由逆转录酶催化而产生的。该酶以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA（其中U与A配对）。 cDNA 探针是目前应用最为广泛的一种探针。

　　3、RNA探针：
　　RNA探针是一类很有前途的核酸探针，由于RNA是单链分子，所以它与靶序列的杂交反应效率极高。早期采用的RNA探针是细胞mRNA探针和病毒RNA探针，这些RNA是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往往不高，且受到多种因素的制约。这类RNA探针主要用于研究目的，而不是用于检测。 

　　克隆探针：
　　前述三种探针均是可克隆的，一般情况下，只要有克隆的探针，就不用寡核苷酸探针。在DNA序列未知而必须首先进行克隆以便绘制酶谱和测序时，也常应用克隆。
克隆探针的优点：[1]特异性强，从统计学角度而言， 较长的序列复杂度高，随机碰撞互补序列的机会较短序列少；[2]可获得较强的杂交信号，因为克隆探针较寡核苷酸探针掺入的可检测标记基团更多。 

　　4、寡核酸探针：
　　根据已知的核酸序列，采用DNA合成仪合成一定长度的寡核苷酸片段，亦可作为探针使用。若不知核酸序列，可根据蛋白质的氨基酸顺序推倒出核酸顺序，但要考虑到密码子的兼并性。多用于克隆筛选和点突变分析。

　　人工合成的寡核酸探针有下述优点：
　　①短的探针比长探针杂交速度快，特异性。
　　②可以在短时间内大量制备。
　　③在合成中进行标记制成探针。
　　④可合成单链探针，避免了用双链DNA探针在杂交中自我复性，提高杂交效率。
　　⑤寡核苷酸探针可以检测小DNA片段，在严格的杂交条件下，可用于检测在序列中单碱基对的错配。

　　筛选寡核苷酸针的原则 ：
　　①长18～50bp，较长探针杂交时间较长合成量低；较短探针特异性会差些。
　　②碱基成分：G+C含量为40%～60%，超出此范围则会增加非特异杂交。
　　③探针分子内不应存在互补区，否则会出现抑制探针杂交的“发夹”状结构。
　　④避免单一碱基的重复出现（不能多于4个），如-CCCCC-。
　　⑤一旦选定某一序更符合上述标准，最好将序列与核酸库中核酸序列比较，探针序列应与含靶序列的核酸杂交，而与非靶区域的同源性不能超过70%或有连续8个或更多的碱基的同源，否则，该探针不能用。