探针标记方法

       1、DNA的缺口平移法。缺口平移是一种快速、简便、成本相对较低以及生产高比活性均一标记DNA的方法。该技术可以制备序列特异的探针。当使用重组质粒探针时，虽然任何形式的双链DNA都可以进行缺口平移标记。但通常使用限制性核酸内切酶将插入片段进行酶切和凝胶电泳纯化后再进行缺口平移标记。此外，用这种探针进行杂交可产生较低的背景信号。

        2、DNA的随机引物法。这种方法是使用寡核苷酸引物和大肠杆菌DNA聚合酶Ⅰ的Klenow片段来标记DNA片段。这种方法可代替缺口平移产生均一的标记探针外，还在许多方面优于缺口平移法，比如标记核苷酸在DNA探针中的掺入率可达50％以上。由于在反应过程中加入的DNA片段不被降解，故在随机引物反应中加入的DNA可少于200 ng，甚至10 ng也能有效地标记。DNA片段的大小不影响标记的结果。标记物沿所加入的全长DNA被均等地掺入。标记的探针可以直接使用而不需要去除未掺入的核苷酸；单链双链DNA都可作为随机引物标记的模版。随机引物可用于较小的DNA片段（100~500 bp），而缺口平移法对大DNA片段（>1000 bp）效果最好。随机引物法的主要缺点是产生的标记探针量比缺口平移的要少些，此外环状DNA不能有效地标记，必须先用限制性内切核酸酶线形化或用碱法或DNA酶Ⅰ产生缺口。

        3、RNA的体外转录法。体外转录法标记RNA探针可用于商品化转录质粒来制备。这些质粒中应该包括SP6、T3、或T7 RNA聚合酶的RNA启动位点和，而这些启动位点则与多克隆位点（multiple cloning sites，MCS）相邻。

        4、RNA的寡脱氧核苷酸法。克隆质粒pSP64、pGEM-3、pGEM-4等含邻近MCS的SP6RNA启动子，可作为从DNA寡核苷酸模版产生RNA探针的基础。这两种标记方法产生探针量大，而且产生的探针不受载体序列的影响，所需要的线性化的质粒DNA大约1 ug，但需要高纯度的模板。

        5、寡核苷酸的“接尾法”。末端脱氧核苷酸转移酶可将三磷酸脱氧核苷加到DNA分子游离的3’-OH末端。这种脱氧核苷酸连接将在探针3’末端形成一个延伸的“尾巴”。用这种方法可加上许多基因以产生高比活性的探针，适用于基因库中克隆序列的鉴定，基因组DNA样品的点突变检测和原位杂交。

        6、5’端寡核苷酸的T4多聚核苷酸激酶法。T4多聚核苷酸激酶可将γ-32P-ATP的γ-磷转移到游离的5’-OH端上。合成寡脱氧核糖核苷酸时，它们通常未被磷酸化，因而在5’端应含有一个羟基。由于探针分子只掺入了一个同位素分子，故探针活性与其长度有关。短寡核苷酸可被高比活性标记，而较长的探针活性则随其长度增加而降低。这种激酶标记方法最常用于DNA序列测定。

       7、聚合酶链反应标记法。聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）用于标记比活性DNA片段，这种技术具有很高的特异性，可以在1~2 h之内大量合成探针DNA片段，标记物的掺入率可高达70％~80％。因此，PCR标记技术特别适用于大规模检测和非放射性标记。该方法的缺点是需要合成一对特异性PCR引物。使用从探针DNA上制备的小片段引物也能取得较好的标记效果。

       一般来说，核酸探针的检测方法应根据核酸探针的标记物来决定。放射性同位素可通过放射自显影而使其标记的核酸探针得到检测。下面为非放射性标记探针的检测：①碱性磷酸酶（AKP）显示系统。ASO-AKP + BCIP（pH9.5）→ BCl-OH + Pi；BCl-OH + NBT → 紫色。此系统中核酸探针以AKP为标记物。ASO：等位基因特异的寡核苷酸，BCIP：5-溴-4氯-3-吲哚磷酸，NBT：四氮唑蓝，Pi：磷酸。②辣根过氧化物酶（HRP）显示系统。HRP + H2O2 → [HRP: H2O2 ]；ODA-NH2 + [HRP: H2O2 ] → ODA-N = ODA/棕色 + HRP + H2O。此系统的核酸探针以HRP为标记物。ODA：邻-联茴香胺。③ABC显示系统。DNA-B + SA-酶 → DNA-B-SA 或DNA-B + SA-生物素化的酶 → DNA-B-SA-生物素化的酶。此系统的核酸探针以生物素（biotin，B）为标记物，然后利用亲和素（avidin，A）、生物素以及酶三者形成的复合物（complex，C）在该酶的显色反应下以完成对核酸探针的检测。SA：streptavidin-链酶亲合素，ABC即为avidin-biotin-enzyme complex-亲合素-生物素-酶复合物。酶可选用AKP或HRP，然后以各自的酶显色系统进行显示。