化学发光免疫分析方法类别及未来发展方向

近年来，化学发光免疫分析方法由于其具有灵敏度高、特异性强、适用面广、所需设备简单、线性范围较宽等优点，日益受到人们的青睐，在生命科学、临床医学以及环境、食品、药物等领域得到广泛应用。实际检测常常需要对大量、复杂、低丰度的样品进行测定，因而化学发光免疫分析法逐渐向快速、高通量、高灵敏检测的方向发展。

化学发光免疫分析方法类别

根据化学发光免疫分析体系中所选标记物的不同，将化学发光免疫分析方法分为化学发光免疫分析、化学发光酶免疫分析及电化学发光免疫分析三大类。

化学发光免疫分析是用化学发光标记物质直接标记抗体或抗原的一类免疫分析方法。作为化学发光标记物，目前使用最多的是鲁米诺类和吖啶酯类这两类物质。

(1) 鲁米诺类物质标记的化学发光为氧化反应发光。在碱性环境中，鲁米诺可被许多物质氧化发光，其中过氧化氢(H₂O²)最为常用。为了提高化学发光反应速率，需向这一反应体系中添加某些酶类或无机催化剂。催化用的酶类主要选择辣根过氧化物酶(HRP)，无机催化剂主要包括O₃、卤族元素及Fe³⁺、Cu²⁺、Co²⁺和它们的配合物。

(2) 吖啶酯类物质标记的化学发光是在碱性环境中，吖啶酯类物质被H₂O²氧化，迅速产生光子，具有很好的量子产率。将吖啶酯类物质作为化学发光免疫分析的化学发光标记物，具有发光体系简单、反应速率快、无需催化剂、标记效率高、发光本底低等优点。

化学发光酶免疫分析是用酶标记抗原或抗体的一类化学发光免疫分析方法。酶标记抗原或者抗体进行特异性免疫反应后，免疫反应复合物上的酶催化化学发光底物在信号试剂作用下发光。目前应用最为广泛的标记酶是HRP和碱性磷酸酶(ALP)，这两种酶都有各自的发光底物。HRP最常用的发光底物是鲁米诺及其衍生物。在化学发光酶免疫分析中，使用HRP标记抗体或抗原，免疫反应后，将鲁米诺作为发光底物，在碱性环境及HRP存在下，鲁米诺被H₂O₂氧化发光，HRP的浓度决定了化学发光的强度。这一传统的化学发光体系(HRP-H₂O^2-鲁米诺)为持续几秒的闪光型发光，存在发光强度低、不易测量等缺点。在这一化学发光反应体系中加入化学发光增强剂，可大大增强发光信号，并在较长的时间内保持发光稳定，从而提高这一化学发光反应体系的分析灵敏度和准确性。ALP最常用的发光底物是1,2-二氧环已烷类物质。这类化学发光体系中最为经典的是Bronstein等提出的3-(2-螺旋金刚烷)-4-甲氧基-4-(3-磷氧酰)-苯基-1,2-二氧环乙烷二钠盐(AMPPD)-ALP发光体系。这一化学发光反应体系的特点是反应速度快，短时间可提供检测结果。

电化学发光免疫分析是将电化学发光与免疫分析相结合的一类化学发光免疫分析方法。电化学发光是一种在电极表面由电化学引发的特异性化学发光反应。电化学发光学发光的差异在于电化学发光是电启动发光反应，而化学发光是通过化合物混合起动发光反应，因此电化学发光反应易精确控制。电化学发光免疫分析最常用的发光底物是三联吡啶钌[Ru(byp)₃²⁺]，三丙胺(TPA)用来激发这个体系的发光反应。在阳极表面，Ru(byp)₃²⁺和TPA同时失去电子，Ru(byp)₃²⁺被氧化成Ru(byp)₃³⁺，TPA被氧化成阳离子自由基(TPA^+*)，TPA+*将自发地释放一个质子而变成非稳定分子(TPA^*)，并将一个电子传递给Ru(byp)₃³⁺，形成激发态的Ru(byp)₃²⁺*，Ru(byp)₃²⁺*在衰减的同时发射一个波长为620n的光子，重新回到基态Ru(byp)₃²⁺。这一反应过程在电极表面反复进行，从而产生高效、稳定的连续发光，发光强度不断增强。

化学发光免疫分析方法发展方向

整体而言，化学发光免疫分析方法相对于传统的酶联免疫分析方法有着较高的灵敏度，但其方法的批内批间变异系数会高于酶联免疫分析方法。其原因主要是现有的化学发光标记物在发光达到顶峰衰减后，其发光值尚不十分稳定。因此，化学发光免疫分析方法仍需在以下几方面开展研究。1)继续筛选新的化学发光标记物；2)在现有化学发光反应体系中，开展化学发光增敏体系研究；3)加强电化学发光免疫分析方法在食品安全检测领域的应用研究。可以预计，随着科学家们更多的关注于解决化学发光标记物发光稳定性问题，化学发光免疫分析方法在其他领域将得到更为广泛全面的应用。

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