常用的分子诊断技术有哪些

随着分子生物学和分子遗传学的发展，越来越多的分子诊断学技术应用于疾病的诊断，彻底打破常规的诊断方式，不再以疾病的表型为主要依据推测疾病的发生发展及相关机制。分子诊断学技术，通过检测遗传物质的结构或表达水平，不但发现了疾病与特定基因存在、转录及表达有关， 而且个体基因多态性与疾病特定用药密切相关。

常用分子诊断技术

1953年Watson和Crick提出DNA双螺旋结构模型，并在此基础上提出中心法则，描述遗传信息从基因到蛋白质的流动，标志着分子生物学作为一个独立学科的诞生。纵观分子诊断60年的发展历史，分子诊断学技术大致分为三大方面：分子杂交技术、基因扩增技术和基因测序技术。分子诊断学技术具有自动化、快速化、准确化等特点，在疾病的诊断、治疗、预后方面发挥越来越重要的作用。

1、分子杂交技术

分子杂交是指具有同源序列的两条核酸单链，在一定条件下按照碱基互补配对原则形成双链的过程。上世纪60年代开始，杂交技术得到迅猛的发展，能够通过已知基因序列的探针对靶序列进行捕获检测。主要技术有菌落原位杂交、斑点杂交、Southern印迹、Northern印迹、荧光原位杂交、芯片杂交等。原位杂交技术是利用碱基互补配对的原则，将靶基因在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。1975年Southern发明了DNA印迹技术，该方法利用DNA片段酶切和分子探针杂交技术，保证检测的特异性。目前，Southern印迹法仍为探针杂交领域最经典的分子检测方法，在基因突变的检测方面广为应用。1977年Rudkin使用荧光素标记探针，发明了荧光原位杂交，使得原位杂交技术准确性更高，灵敏度更强。原位杂交技术主要应用于基因定位、癌症基因检测和判断等方面。1991年Affymetrix公司的Fordor研发了光蚀技术，制备了首个以玻片为载体的微阵列，标志着芯片技术正式成为可实际应用的分子生物学技术。基因芯片，又称DNA微阵列，是由大量DNA或寡核苷酸探针密集排列在载体表面，通过核酸杂交原理，用于检测DNA序列的新工具。基因芯片技术具有高通量、高灵敏度、微型化、自动化等特点，在单核苷酸多态性(singlenucleotidepolymorphism,SNP)检测、前诊断、药物筛选等均有应用。

2、基因扩增技术

1983年美国Cetus公司的Mullis发明了聚合酶链反应技术(polymerasechain

reaction,PCR)，该技术利用DNA高温变性和低温复性的原理，通过变性、复性和延伸3个温度变化，成功实现核酸片段的体外扩增。PCR技术以其特异性高、灵敏度高、简便、快速，对标本的纯度要求低等优点，被广泛应用到医学、农业、食品检验等领域。PCR技术分为两种：常规PCR技术和实时PCR技术。常规PCR技术，指仅对PCR扩增反应的终点产物进行定性或半定量分析，无法对起始模板准确定量，也无法对扩增反应实时检测的一项核酸扩增技术，但该技术所需技术平台和仪器设备较低，花费成本相对也低，目前临床上主要运用该平台对定性项目进行检测，例如：缺失基因、突变基因、融合基因等的检测。实时PCR技术，又称实时定量荧光PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的技术。实时PCR技术，具有特异性强、准确度高、重复性好等特点，在检验医学上主要应用于核酸定量、mRNA表达水平分析等，可以分析和指导临床用药、监测药物疗效、判断病情进展。基因测序技术1977年Maxam提出了化学修饰降解法模型，为核酸测序时代的到来拉开序幕。同年，Sanger等发明了DNA双脱氧链末端终止法，可以检测物种或细胞的核酸序列，再与基因库进行比对，从而知道被检测物种或细胞的特性。Sanger法作为最经典的测序方法，读取序列长，能够较好地处理重复序列和多聚体，仍为目前常用的测序方法，广泛应用于基因组DNA、cDNA等多重复序列的检测。该技术不足之处：灵敏度较低，通量较低。1998年Ronaghi发明了焦磷酸测序法，其基本原理是利用引物延伸时所释放的焦磷酸基团激发荧光，通过峰值高低判断与其匹配的碱基数量。比起Sanger法，提高了灵敏度，在SNP位点检测、等位基因突变测定等广泛运用。近几年，发明了高通量测序技术，是对传统技术的一次革命性的创新。该技术通过DNA片段化构建DNA文库、文库与载体交联进行扩增、在载体面上进行边合成边测序反应，完成对海量数据的高通量测序。该技术测序速度快、准确度高，可以进行大规模的测序检测，主要应用于全基因组序列、内含子序列、外显子序列等的分析和研究。

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