解析韩春雨新版实验方法，其中增加了什么内容？

本文转自科研圈 医麦客
2016年8月8日，韩春雨向非盈利性质粒共享信息库 Addgene 提交了其 NgAgo 技术的新版详细实验方法。同时，一项已有近200名科研人员参与的在线调查显示，目前有 9 人声称在实验中观察到 NgAgo 的基因编辑效果。科研圈对比分析了韩春雨新公开的实验细节，并对相关事件进行简要解读。
整理   赵维杰 张帅琰 吴兰
三个月前，河北科技大学副教授韩春雨在《自然-生物技术》上发表了 NgAgo 酶对哺乳动物进行基因编辑的论文（F. Gao et al. Nature Biotechnol. 34, 768–773; 2016）。文章介绍了一种新型的基因编辑方法，迅速引起广泛关注。
然而，随着时间推移，研究的可重复性问题为韩春雨团队招致诸多质疑。8月2日，《自然-生物技术》宣布将按照既定流程对研究进行调查。8月8日，韩春雨向质粒共享信息库 Addgene 提交新版的详细实验方法，其中补充了数项应特别注意的问题。
（新版实验方法全文，可至 https://www.addgene.org/static/data/plasmids/78/78253/78253-attachment_OG34WIqLRecj.docx 下载）。
新版实验方法具体分为细胞培养、质粒/gDNA 共转染，以及基因组提取三个部分。对比《自然-生物技术》上 NgAgo 论文 Supplementary Information 中描述的 methods（详见 http://www.nature.com/nbt/journal/v34/n7/full/nbt.3547.html#supplementary-information），新实验步骤有几处改变：
1   血清品牌由 Hyclone 变更为 Gibco 。
2   增加了关于“293T 细胞贴壁不牢，换液时要小心操作”的小提示。
3   建议在质粒/gDNA共转染的8小时、12小时或24小时后，补转一次 gDNA；旧版方法中只提及了“24小时”。
4   旧版方法中，溶解和稀释质粒及 gDNA 的缓冲液为含有 EDTA 的0.5xTE（5 mM Tris-HCl,  0.5 mM EDTA,  pH 8.0），而新方法中则变更为水（pH 8.0）。
最后一处缓冲液配方的改变尤其引人注意——在韩春雨补充在实验步骤之后的四条注意事项中，EDTA 再次出现：其中一条注意事项专门提到，应该避免向 NgAgo/gDNA 系统中加入 EDTA。这四条注意事项分别是：
1   NgAgo/gDNA 系统对细胞中胞内菌和支原体感染敏感，在实验前要仔细确认所使用的细胞株未被污染或污染已被彻底清除。
2  由于 NgAgo/gDNA 系统需要镁离子，在细胞消化和培养过程中要避免使用金属离子螯合剂 EDTA。也可以在培养基中额外加入 5 mM或其他浓度的镁离子。
3  转染试剂 Lipofectamine® 3000会阻碍 gDNA 进入细胞，不能用于转染。可以使用转染试剂 Lipofectamine® 2000。其他转染试剂是否可用还有待验证。

4 建议使用 T4 PNK (Biolab) 对 gDNA 进行5’端磷酸化处理，处理体系如下：（体系略）处理后的 gDNA 无需再次纯化，直接用水（pH 8.0）稀释至300 μl，终浓度10 nM。
据 Nature 报道，韩春雨近来每天都会收到很多骚扰电话和短信，但他始终坚信自己的研究成果没有问题。Nature 将喜爱茶叶、古琴，并且从未出国的韩春雨称为“隐士”，而今这位隐士不得不走上风口浪尖，直面质疑。 据新华网消息，河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验，并邀第三方证实。
为什么 NgAgo 会“不好使”？
NgAgo 之所以引起广泛关注，在于其作为基因编辑工具显现出的一些令人激动的新特性，赋予了其可观的应用潜力。例如，NgAgo 系统没有 PAM 序列依赖性，与 CRISPR 系统只能识别附近有 PAM 序列的靶点相比，NgAgo 理论上可切割的序列更多。其次，NgAgo 系统用以识别靶基因的先导物为 DNA（gDNA），与 CRISPR 使用的 gRNA 相比，易用性更强，成本更低。另外，NgAgo 系统可以作用于很难被 CRISPR 切割的 GC 富集区域。
与此同时，NgAgo 系统也表现出一些劣势。NgAgo 系统使用 5’ 端磷酸化 gDNA ，这种先导物无法从质粒里表达获得，不能在靶细胞里产生，只能在细胞外合成后输入细胞内；研究者在执行基因编辑时，可能还需要持续向细胞内补充 gDNA。并且，gDNA 只能与新生的未成熟 NgAgo 蛋白结合形成复合物。

爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 专门研究基因编辑系统的优化，他表示，NgAgo 系统的目前的可重复性难题，无疑说明了这一系统的优化工作非常困难；他同时认为，NgAgo 系统难以优化的原因，可能就包括 s' 端磷酸化后的 gDNA 在哺乳细胞中不能稳定持续存在，以及 NgAgo 蛋白无法在成熟状态下与 gDNA 形成复合物。
已有9人声称 NgAgo 有效
自韩春雨2016年3月在线发表论文后，来自全世界的科研人员共发出将近400次获取 NgAgo 质粒的请求。Pooran Dewari 面向正在重复 NgAgo 的科研人员发起了一项调查。调查发现，截至2016年8月8日，193名被调者中，各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象（indels and knock-in），100人声称无法观察到剪切，47人声称无法观察到基因插入。

然而，调查还显示，大部分被调者仍未对 NgAgo 丧失耐心，其中66%的被调者表示会等待他人对这一系统的优化结果，10%的被调者表示会自己优化 NgAgo，24%的人表示将继续使用 CRISPR。

附：NgAgo 可重复性问题事件节点
· 2016年6月，网络上逐步有传言称，国内外有多家实验室重复不出韩春雨论文的实验结果，引起部分科学家的质疑。韩春雨在回复中表示，新系统刚出来都会“不好使”，他也认同目前 NgAgo 系统不够稳定，等2.0版本出来会找专门机构免费发放。
· 7月2日，方舟子公开质疑该实验的可重复性，NgAgo 研究可重复性问题自此规模化发酵，韩春雨也立刻进行了实验方法上的回应，称实验重复失败可能是由于支原体污染、试剂保存等问题。
· 7月28日，先前声称 NgAgo 有效的澳大利亚遗传学家 Gaetan Burgio 在 Twitter 上表示，经进一步检测，该技术无法进行基因编辑。他表示，NgAgo 也许会奏效，但鉴于其不稳定性，它并没有 CRISPR 实用。
· 7月29日，西班牙遗传学家 Lluís Montoliu 向国际转基因技术协会 （ISTT） 的同僚群发邮件，建议“放弃所有NgAgo相关项目”。与此同时，之前声称 NgAgo 有效的印度分子生物学家 Debojyoti Chakraborty 及德国癌症研究中心的遗传学博士生 Jan Winter 也都表示先前结论有误；Jan Winter 同时表示，自己并不认可韩春雨此前做出的回应。

· 截至8月8日，爱丁堡大学 MRC 再生医学中心的博士后 Pooran Dewari 发起的一项针对 NgAgo 研究可重复性的线上调研已经收到近 200 位研究者的回复，其中各有9人声称在应用 NgAgo 系统后观察到了基因剪切或插入迹象（indels and knock-in），100人声称无法观察到剪切，47人声称无法观察到基因插入。
· 据新华网消息，河北科技大学将要求韩春雨在一个月内重复实验，并邀第三方证实。